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HTRF SLP-76 P-Y145 KIT - 500 PTS 磷酸化血源性细胞接头蛋白（酪氨酸145）HTRF检测试剂盒

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概述

本 HTRF（均相时间分辨荧光）细胞检测方法可实现对酪氨酸 145（Tyr145）位点磷酸化的 SLP-76 蛋白的快速、定量检测。ZAP-70 激酶对 SLP-76 的磷酸化作用会形成一个支架，关键信号复合物可在该支架上组装，进而触发 T 淋巴细胞激活。在 T 免疫细胞中，SLP-76（Tyr145）的磷酸化水平被视为 ZAP-70 激活通路的直接读数指标。

工作原理

SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测原理

注：原文中 “Ser376” 应为笔误，结合上下文及检测名称，修正为 “Tyr145”。

SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测针对 Tyr145 位点发生磷酸化的 SLP-76 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为 “免洗涤” 检测模式下评估蛋白质磷酸化状态提供了有效手段。

（图示标注：Phospho how it works slp76 y145 assay principle，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测原理”）

SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入 SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

（图示标注：Phospho how it works slp76 y145 assay protocol 1，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）双板检测方案”）

SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Tyr145 位点磷酸化的 SLP-76 蛋白，可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。此专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：Phospho how it works slp76 y145 assay protocol 2，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）单板检测方案”）

检测验证

人 Jurkat 细胞中 SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）细胞检测：HTRF 法与蛋白质印迹法的对比

将 Jurkat 细胞接种于 T175cm² 培养瓶中，在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中，于 37°C、5% 二氧化碳环境下培养 2 天。取 1.8 毫升细胞悬液（浓度为 1×10⁷个细胞 / 毫升），用钒酸盐（终浓度 10 毫摩尔）刺激 15 分钟。刺激结束后，加入 0.6 毫升 4 倍浓度（4X）补充型裂解缓冲液，在室温下裂解细胞 30 分钟。随后用相同的补充型裂解缓冲液对裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液，分别通过 HTRF 法和蛋白质印迹法进行平行分析。

通过抗 CD3 抗体处理实现 T 细胞受体（TCR）的特异性激活，该过程可通过 HTRF 法检测（见下文 “药理学验证” 部分），但由于蛋白质印迹法灵敏度不足，无法检测到这一激活过程。

（图示标注：Assay validation slp76 y145 1，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测验证 1”）

特异性抗 CD3 抗体激活剂刺激细胞的动力学研究

本检测采用双板方案进行：在 96 孔培养板中，每孔接种 40 万个 Jurkat 细胞，加入 25 微升含 10% 胎牛血清的完全 RPMI 培养基。使用终浓度为 20 微克 / 毫升的抗 CD3 抗体对细胞进行刺激，设置不同刺激时间（分钟）。刺激结束后，加入 10 微升 4 倍浓度补充型裂解缓冲液裂解细胞。取 16 微升不同条件下的细胞裂解液，通过 HTRF 法分别检测 SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）和总 SLP-76 的水平。

结果显示，抗 CD3 抗体可显著诱导 SLP-76 磷酸化，刺激 5 分钟后磷酸化水平达到峰值，而相同条件下总 SLP-76 的表达量保持稳定。

（图示标注：Assay validation slp76 y145 2，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测验证 2”）

人 Jurkat 细胞中 SLP-76 激酶活性的调控研究

将永生化 T 淋巴细胞系 Jurkat 细胞接种于 96 孔培养处理板中，每孔 40 万个细胞，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳环境下孵育过夜。

为实现 SLP-76 的激活，用不同浓度的抗 CD3 抗体处理细胞 5 分钟；处理结束后，加入 50 微升 4 号补充型裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）或总 SLP-76 的 HTRF 检测试剂。其中，SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测需孵育 3 小时后记录 HTRF 信号，总 SLP-76 检测则需孵育过夜后记录信号。

结果显示，抗 CD3 抗体可显著激活 ZAP-70 通路，使 Jurkat 细胞中 SLP-76 的磷酸化水平提升 3 倍，而相同条件下总 SLP-76 的表达量保持稳定。

（图示标注：Assay validation slp76 y145 3，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）检测验证 3”）

简化通路

SLP-76 的功能与调控机制

T 细胞受体（TCR）结合后，淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）会催化 TCR/CD3 复合物胞质侧的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）发生磷酸化。ZAP-70 被招募至 TCR/CD3 复合物并发生磷酸化激活，激活后的 ZAP-70 进一步催化 SLP-76 磷酸化。磷酸化激活的 SLP-76 转移至细胞膜，促进多蛋白复合物的形成，该复合物参与 T 淋巴细胞的激活、存活与增殖过程。

（图示标注：Phospho pathway slp76 y145，即 “SLP-76（Tyr145 位点磷酸化）相关简化通路”）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
自动化兼容性：是（Yes）
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64SLPY5PEG

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