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HTRF ZAP-70 P-Y319 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 ZAP-70（Tyr319）细胞检测试剂盒是监测 T 细胞活化的理想工具，T 细胞活化会导致 ZAP-70 在酪氨酸 319 位点发生磷酸化。ZAP-70 是一种在 T 细胞和自然杀伤细胞中表达的胞质蛋白酪氨酸激酶，在抗原受体启动 T 细胞应答的相关事件中发挥关键作用。

工作原理

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）检测原理

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）检测可测量在酪氨酸 139 位点发生磷酸化的 ZAP-70。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加磷酸化 ZAP-70（Tyr139）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ZAP-70（Tyr139）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在人 Jurkat 细胞上使用磷酸化 ZAP-70（Tyr319）细胞检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

Jurkat 细胞在添加 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中，于 37°C、5% CO₂环境下的 T175cm² 培养瓶中培养 2 天。取 4.5ml 细胞悬液（13×10⁶个细胞 /ml），用抗 CD3 抗体（终浓度 20µg/ml）刺激 2.5 分钟。刺激后，加入 2.25ml 4 倍浓度的补充裂解缓冲液，在室温下裂解细胞 30 分钟。然后用相同的补充裂解缓冲液对纯裂解物进行系列稀释。取 16µL 各稀释液分别通过 HTRF 或蛋白质印迹法进行平行分析。

磷酸化 ZAP-70（Tyr319）的细胞密度优化

本检测采用双板检测方案进行。将 Jurkat 细胞以 20 万个或 40 万个细胞 / 孔、25µL / 孔的量接种到 96 孔培养板中，使用含 10% 胎牛血清的完全 RPMI 培养基。用终浓度为 20µg/ml 的抗 CD3 抗体刺激细胞 2.5 分钟。使用 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。将 16µL 各细胞裂解物转移到检测板中，使用 HTRF 磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测试剂盒进行分析。

细胞刺激动力学 —— 磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测

本检测采用双板检测方案进行。将 Jurkat 细胞以 40 万个细胞 / 孔、25µL / 孔的量接种到 96 孔培养板中，使用含 10% 胎牛血清的完全 RPMI 培养基。用终浓度为 20µg/ml 的抗 CD3 抗体在不同刺激时间（分钟）下刺激细胞。刺激后，用 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。取 16µL 各类型细胞裂解物，用 HTRF 磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测试剂盒进行分析。

免疫检查点抑制剂 PD-L1 活性的监测

由于磷酸化 ZAP-70（Tyr319）是 T 细胞活化的读出指标，因此可用于监测 PD-L1 重组蛋白对 T 细胞活化的抑制作用。本检测采用双板检测方案进行。将 40 万个 Jurkat 细胞以 25µL 含 10% 胎牛血清的完全 RPMI 培养基接种到 96 孔培养板中。将细胞与不同浓度的 PD-L1 重组蛋白预孵育 24 小时。然后用 20µg/ml 的抗 CD3 抗体（终浓度）刺激细胞 2.5 分钟，直接加入 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞，随后在室温下孵育 30 分钟。取 16µL 各样品，用磷酸化 ZAP-70（Tyr319）和总 ZAP-70 检测试剂盒进行分析。将磷酸化 ZAP-70 的结果以总 ZAP-70 的量进行标准化后绘制图表。结果显示，当 PD-L1 重组蛋白的终浓度为 40µg/ml 时，磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测记录到其具有轻微但显著的抑制作用。

简化通路

ZAP-70 的功能与调控
T 细胞受体（TCR）结合会促进淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）对 TCR/CD3 复合物胞质侧的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs）进行磷酸化。ZAP-70 被募集到 TCR/CD3 复合物上，在此发生磷酸化并被激活，进而促进下游衔接蛋白或支架蛋白的募集与磷酸化。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64ZAPPEY

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