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HTRF SMAD2 P-S465/467 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸 465/467（Ser465/467）位点磷酸化的 SMAD2，可作为转化生长因子 -β（TGF-ß）信号活性的读数指标。

TGF-ß 受体通过在 Ser465/467 位点磷酸化直接激活 SMAD2，使其转运至细胞核内，调控参与凋亡、迁移、分化以及免疫 / 炎症反应和细胞外基质重塑的基因表达。

工作原理

磷酸化 SMAD2（Ser465/467）检测原理

磷酸化 SMAD2（Ser465/467）检测用于测量在 Ser465/467 位点发生磷酸化的 SMAD2。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 SMAD2（Ser465/467）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 SMAD2（Ser465/467）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 SMAD2（Ser465/467）HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 SMAD2（Ser465/467）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 SMAD2（Ser465/467）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

人 TGFβ 刺激 C2C12 细胞导致 SMAD2 蛋白丝氨酸 465/467 残基磷酸化

将 C2C12 细胞以不同密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜后，向细胞中加入系列稀释的人 TGFβ，在 37°C、5% CO₂条件下处理 30 分钟。移除刺激培养基，向细胞中加入 50µL 裂解缓冲液。轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16µL 样品转移至 384 孔小体积板中，然后加入 4µL 磷酸化 SMAD2 HTRF 检测试剂。过夜后记录信号。

人源和鼠源细胞系上的磷酸化 SMAD2 Ser465/467 细胞检测验证

选择 HeLa 细胞用于测试人源兼容性，选择 NIH 3T3 和 C2C12 细胞用于测试鼠源兼容性。将这些不同模型的 100,000 个细胞接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜后，向细胞中加入系列稀释的人 TGFβ，在 37°C、5% CO₂条件下处理 30 分钟。移除刺激培养基，向细胞中加入 50µL 裂解缓冲液。轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16µL 样品转移至 384 孔小体积板中，然后加入 4µL 磷酸化 SMAD2 HTRF 检测试剂。过夜后记录信号。

磷酸化 SMAD2 HTRF 检测能够检测到丝氨酸 465/467 位点磷酸化状态的人源和鼠源 SMAD2 蛋白。

基于小鼠 C2C12 细胞的磷酸化 SMAD2 细胞检测：HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将小鼠 C2C12 细胞培养至 80% 汇合度。经人 TGFβ 处理后，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 SMAD2 HTRF 细胞检测试剂盒试剂。平行比较显示，HTRF 磷酸化检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 32 倍。

简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号通过 TßRI 和 TßRII 复合物介导，该复合物通过磷酸化激活细胞内的 SMAD3 和 SMAD2。TGF-ß 配体与 TßRII 结合，触发 TßRI 招募到配体 - 受体复合物中。TßRII 发生自身磷酸化，然后转磷酸化 TßRI。激活的 TßRI 进而磷酸化 SMAD2 的 Ser465 和 Ser467 位点，使其能够与 SMAD4 形成寡聚体。该复合物随后转运至细胞核内，作为转录因子与共激活因子和共抑制因子共同作用，调控参与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化以及细胞外基质重塑和免疫 / 炎症反应的多个基因的表达。抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64SMAD2S5PEY

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