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HTRF (H/M) SMAD4 P-T277 KIT - 500 PTS

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概述

本 HTRF（均相时间分辨荧光）细胞检测方法可实现对苏氨酸 277（Thr277）位点磷酸化的 SMAD4 蛋白的快速、定量检测，该指标可作为转化生长因子 -β（TGF-ß）信号通路活性的检测依据。

TGF-ß 受体通过磷酸化作用直接激活 SMAD2/3 复合物，促使其与磷酸化 SMAD4 结合，形成的复合物随后转移至细胞核内，调控与细胞凋亡、迁移、分化，以及免疫 / 炎症反应、细胞外基质重塑相关的基因表达。

工作原理

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）检测原理

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）检测针对 Thr277 位点发生磷酸化的 SMAD4 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为 “免洗涤” 检测模式下评估蛋白质磷酸化状态提供了有效手段。

（图示标注：phospho-how-it-works-smad4-phospho-t277-assay-principle，即 “SMAD4（Thr277 位点磷酸化）检测原理”）

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入 SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测试剂。

该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

（图示标注：phospho-how-it-works-smad4-phospho-t277-assay-protocol，即 “SMAD4（Thr277 位点磷酸化）双板检测方案”）

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Thr277 位点磷酸化的 SMAD4 蛋白，可在单个培养板中完成 —— 该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。

此专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：phospho-how-it-works-smad4-phospho-t277-assay-protocol，即 “SMAD4（Thr277 位点磷酸化）单板检测方案”）

检测验证

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）细胞系兼容性验证

选取 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞系）和 HAPI 细胞（人小胶质细胞系）验证人源蛋白兼容性，选取 NIH 3T3 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）验证鼠源蛋白兼容性。将这三种细胞系分别以每孔 2.5 万、5 万和 10 万个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 48 小时。移除细胞培养基，向每孔加入 50 微升（µL）裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升 1:2 稀释的纯样本转移至 384 孔小体积检测板，加入 4 微升 SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测试剂，孵育过夜后记录信号。

该实验数据可为不同细胞系选择更适宜的细胞密度提供依据。结果显示，SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测可同时检测人源和鼠源的磷酸化 SMAD4 蛋白。

（图示标注：assay-validation-smad4-phospho-t277，即 “SMAD4（Thr277 位点磷酸化）细胞系兼容性验证”）

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）检测特异性验证

将野生型 HAPI 细胞（HAPI wt）以每孔 2.5 万个细胞的密度接种到 96 孔板中。

在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，用 25 纳摩尔（nM）的 ON-TARGETplus 小干扰 RNA（siRNA，购自 Horizon Discovery）处理细胞，该 siRNA 可特异性靶向 SMAD2、SMAD3 和 SMAD4；同时设置非靶向 siRNA 处理组作为对照。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，更换为完全培养基，继续在 37°C 条件下孵育 24 小时。

将 SMAD4 基因敲除 HAPI 细胞（HAPI SMAD4 KO，购自 Horizon Discovery）以每孔 2.5 万个细胞的密度接种到 96 孔板中，孵育 4 天。

孵育结束后，用 50 微升 4 号补充型裂解缓冲液（1 倍浓度）裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升预混合的 SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示：用 SMAD4 siRNA 处理的细胞，总 SMAD4 表达显著下调，与非靶向 siRNA 转染组相比，磷酸化 SMAD4 水平下降 61%；此外，在 SMAD4 基因敲除 HAPI 细胞的裂解液中未检测到 HTRF 信号。

另一方面，用 SMAD2 或 SMAD3 siRNA 处理的细胞，其 HTRF 信号未出现下降，证明该试剂盒具有特异性。使用 HTRF 总 SMAD2 和总 SMAD3 检测试剂盒检测，确认 SMAD2 和 SMAD3 的表达已分别下调 60% 和 66%。

（图示标注：assay-validation-smad4-phospho-t277，即 “SMAD4（Thr277 位点磷酸化）检测特异性验证”）

SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将 HAPI 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养至 80% 汇合度。

用 3 毫升 4 号补充型裂解缓冲液（1 倍浓度）在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

用 4 号补充型裂解缓冲液（1 倍浓度）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升纯样本及各稀释度样本转移至 384 孔小体积微孔板，加入 4 微升 SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测试剂，孵育过夜后记录信号。

取等量裂解液上样至凝胶，进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行对比。

结果显示，在该实验条件下，SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

（图示标注：assay-validation-smad4-phospho-t277、assay-validation-smad4-phospho-t277-4，即 “SMAD4（Thr277 位点磷酸化）HTRF 检测与蛋白质印迹法对比”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
自动化兼容性：是（Yes）
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64SMAD4T7PEG

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