当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF C-SRC P-Y419 KIT - 500 PTS 磷酸化c-Src试剂盒 - 500测试

HTRF C-SRC P-Y419 KIT - 500 PTS 磷酸化c-Src试剂盒 - 500测试

分享给好友

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

磷酸化 c-Src（Tyr419）检测（Phospho-c-Src (Tyr419) Assay）旨在监测 c-Src 蛋白的表达水平及其在 Tyr419 位点的自磷酸化水平 —— 该位点的自磷酸化是 c-Src 激活的标志之一，广泛应用于癌症研究领域。

c-Src 属于 Src 激酶家族，与该家族其他 10 个成员具有高度的序列同源性。作为一种膜相关非受体酪氨酸激酶，其 Tyr419 位点的自磷酸化意味着蛋白完全激活。在多种人类癌症中，c-Src 激酶存在过表达且活性显著升高的现象。

工作原理

磷酸化 c-Src Tyr (419) 检测原理

磷酸化 c-Src Tyr (419) 检测可定量分析 c-Src 在 419 位酪氨酸（Tyr419）的磷酸化水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。其中，第一种抗体可特异性结合蛋白上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白磷酸化状态识别目标蛋白。当蛋白发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，可在免洗涤检测模式下实现对蛋白磷酸化状态的评估。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-c-src-tyr149-assay-principle.svg，即 “磷酸化 c-Src Tyr (419) 检测原理示意图”）

磷酸化 c-Src Tyr (419) 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入磷酸化 c-Src Tyr (419) HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-c-src-tyr149-2-plate-assay-protocol.svg，即 “磷酸化 c-Src Tyr (419) 双板检测方案流程示意图”）

磷酸化 c-Src Tyr (419) 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 c-Src Tyr (419) 时，可在单个培养板中完成所有操作 —— 该培养板可同时用于细胞培养、刺激处理及裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）专用方案可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-c-src-tyr149-2-plate-assay-protocol.svg，即 “磷酸化 c-Src Tyr (419) 单板检测方案流程示意图”）

检测验证

利用 siRNA 在 HEK293 细胞中验证 c-Src 相关 HTRF 检测的特异性

将人 HEK293 胚胎肾细胞接种并培养 24 小时，随后用 c-Src siRNA（小干扰 RNA）或阴性对照 siRNA 转染细胞，再用浓度递增的过氧化氢（H₂O₂）处理细胞，之后移除培养基并裂解细胞。将裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入试剂盒检测试剂。

结果显示：与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 c-Src siRNA 的细胞的 HTRF 信号显著下降（约 75%），这表明两种检测试剂盒均对 c-Src 具有特异性，且不会与其他 Src 家族成员发生交叉反应。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-1.svg，即 “利用 siRNA 在 HEK293 细胞中验证 c-Src HTRF 检测特异性的结果图”）

在 A431 癌细胞中对比磷酸化 c-Src 的 HTRF 检测与 Western Blot 检测

将人 A431 癌细胞接种到 T175 培养瓶中培养，直至细胞汇合度达到 80%。细胞裂解后，通过离心收集可溶性上清液，用补充型裂解缓冲液进行系列稀释，再将稀释后的裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化或总蛋白检测试剂。

取等量裂解液进行蛋白质印迹实验，与 HTRF 检测结果进行平行对比。结果显示：磷酸化 c-Src 的 HTRF 检测灵敏度是 Western Blot 的 32 倍，而总 c-Src 的 HTRF 检测灵敏度是 Western Blot 的 8 倍。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-2.png，即 “A431 细胞中磷酸化 c-Src HTRF 检测与 Western Blot 检测对比结果图”）

博舒替尼（Bosutinib）对 HEK293 细胞中 c-Src 活性的抑制作用

将 HEK293 细胞以 1×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。先用浓度递增的博舒替尼处理细胞 30 分钟，再用 20 毫摩尔（mM）的 H₂O₂刺激细胞 10 分钟，之后移除培养基，用 50 微升（µL）3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-3.svg，即 “博舒替尼抑制 HEK293 细胞 c-Src 活性的实验结果图”）

利用 H₂O₂激活人 A431 表皮样癌细胞中的 c-Src

将 A431 细胞以 1×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。用浓度递增的 H₂O₂处理细胞 10 分钟后，移除培养基，用 50 微升 3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-4.svg，即 “H₂O₂激活 A431 细胞 c-Src 的实验结果图”）

在其他人类癌细胞系中的验证

在 96 孔培养板中接种经培养处理的人 HepG2 肝细胞癌细胞、人 HeLa 宫颈癌细胞和人 MCF-7 乳腺癌细胞。孵育后，用 50 微升 3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-5.svg，即 “多种人类癌细胞系中 c-Src 检测的验证结果图”）

H₂O₂处理的小鼠 NIH/3T3 细胞的细胞密度实验

将小鼠 NIH/3T3 胚胎成纤维细胞以不同密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。次日，用浓度递增的 H₂O₂处理细胞 10 分钟，之后移除培养基，用 50 微升 3 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化或总 c-Src 检测试剂，孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-6.svg，即 “H₂O₂处理的 NIH/3T3 细胞密度实验结果图”）

博舒替尼处理的 HEK293 细胞中 HTRF 检测与 ELISA 检测的相关性

将 HEK293 细胞接种并培养 24 小时，先用浓度递增的博舒替尼处理细胞，再用 H₂O₂刺激细胞 10 分钟，之后移除培养基，分别用 ELISA（酶联免疫吸附试验）或 HTRF 试剂盒试剂裂解细胞。

检测 HTRF 信号和比色 ELISA 信号，结果显示：两种方法测得的博舒替尼 IC50（半数抑制浓度）值相近，表明 HTRF 检测与 ELISA 检测具有良好的相关性。

（图示标注：assay-validation-c-src-phospho-y419-7.svg，即 “HEK293 细胞中 c-Src HTRF 检测与 ELISA 检测的相关性结果图”）

简化通路：c-Src 信号通路

c-Src 是一种膜相关非受体蛋白酪氨酸激酶，在所有细胞类型中均有广泛表达。当 c-Src 的 Tyr530 位点发生磷酸化时，激酶处于失活状态；而 Tyr530 位点去磷酸化后，Tyr419 位点发生自磷酸化，是 c-Src 完全激活的标志。

c-Src 主要由受体酪氨酸激酶（RTKs）、整合素和活性氧（ROS）激活，是关键的信号中介分子，可调控多种信号通路，如 AKT 通路、MAPK 通路、STAT 通路和 NF-κB 通路，进而参与调节细胞增殖、分化、存活、形态形成、黏附和迁移过程。因此，精确调控 Src 活性对正常细胞生长至关重要。

作为一种原癌基因衍生的基因，c-Src 在多种人类癌症（如乳腺癌、结肠癌和胰腺癌）中存在过表达且活性高度激活的情况，使其成为癌症治疗领域极具潜力的靶点。

（图示标注：phospho-pathway-c-src-64srcpeg-64srcpeh-64srcpey.svg，即 “c-Src 信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化（Phosphorylation）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64SRCPEG

一键复制

参考价格 ¥ 29723.99

产品规格

1盒/500测试￥29723.99

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价