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HTRF (H/M) STAT6 TOTAL KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

总 STAT6 细胞检测试剂盒旨在监测 STAT6 的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。该试剂盒与我们的磷酸化 STAT6 试剂盒兼容，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 JAK/STAT 信号通路。

工作原理

总 STAT6 检测原理

总 STAT6 检测可定量细胞裂解物中 STAT6 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 STAT6 检测使用两种标记抗体：一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 STAT6 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会靠近并产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白的表达水平。

总 STAT6 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 STAT6 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 STAT6 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 STAT6 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在人和小鼠细胞系上的总 STAT6 检测

将 HeLa 细胞、Raw264.7（小鼠）细胞或悬浮细胞（如 THP1 细胞）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 STAT6 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 STAT6 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 STAT6。

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 STAT6 检测的特异性

使用 HTRF 总 STAT6 试剂盒在 HAP1 细胞（野生型，WT）和 STAT6 敲除的 HAP1 细胞系中评估 STAT6 的表达水平。将细胞以 200,000、100,000、50,000 和 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。然后将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 STAT6 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 STAT6 基因完全沉默，且检测具有良好的特异性；而正如预期的那样，在野生型细胞中可很好地检测到 STAT6 水平。

在 HeLa 细胞系中刺激磷酸化 STAT6 Tyr641

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到经培养处理的 96 孔板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用不同浓度的人白细胞介素 4（hIL4）刺激细胞 20 分钟。按照双板检测方案，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）#64AT6PEG/H/Y 或总 STAT6 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示用 hIL4 处理后，STAT6（Tyr641）的磷酸化呈剂量反应性增强，而 STAT6 的表达水平保持恒定。

在 HeLa 细胞系中抑制磷酸化 STAT6 Tyr641

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到经培养处理的 96 孔板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用不同浓度的鲁索替尼（Ruxolitinib）或 JAK 抑制剂 1 处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂），随后用 5 ng/mL 的 hIL4 刺激 20 分钟。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）或总 STAT6 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示用鲁索替尼或 JAK 抑制剂 1 处理后，STAT6 Tyr641 的磷酸化呈剂量反应性抑制，而 STAT6 的表达水平保持恒定。

HTRF 总 STAT6 检测与蛋白质印迹法的比较

在 T175 培养瓶中，于完全培养基中 37°C、5% CO₂条件下培养 HeLa 细胞。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 STAT6 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 STAT6 检测时，每孔 300 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法（结合 ECL 检测）则需要 20,000 个细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 STAT6 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 60 倍。

简化通路

STAT6 的功能与调控

在细胞因子和生长因子的作用下，STAT6 会被受体相关激酶 JAK 磷酸化。磷酸化后的 STAT6 蛋白形成同源或异源二聚体，并转运至细胞核内，在那里介导细胞因子诱导的基因表达。白细胞介素 4（IL4）是触发 STAT6 酪氨酸 641 残基磷酸化的主要细胞因子，并能诱导 BCL2L1/BCL-X (L) 的表达，而 BCL2L1/BCL-X (L) 是 IL4 发挥抗凋亡活性的关键分子。在较小程度上，已有研究表明 TBK1 对 STAT6 的磷酸化与 STING 通路相关，因此在应对病毒感染的先天免疫中发挥作用。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64STAT6TPEY

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