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HTRF SYK TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

Total SYK 细胞检测可监测总 SYK，且能与我们的磷酸化 SYK（Tyr525/526）试剂盒配合作为归一化检测。该试剂盒与磷酸化 SYK 试剂盒的缓冲液兼容，因此相同的裂解物可用于磷酸化蛋白和总蛋白群体的分析。

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中起着关键作用，尤其在免疫细胞中，如 B 细胞、巨噬细胞、小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）、中性粒细胞和肥大细胞。细胞受到刺激后，SYK 与活化免疫受体的胞质结构域相互作用，并结合到特定的磷酸化受体基序（称为 “p - ITAMs”）上，通过其催化结构域在 Tyr525/526 处的自身磷酸化而被激活。

SYK 磷酸化是关键炎症通路（如 BCR、FcR 和 TREM2 信号通路）的读数，这些通路在多种疾病（如自身免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症和过敏性疾病）中发生改变。

工作原理
总 SYK 检测原理
总 SYK 检测可定量细胞裂解物中 SYK 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜。总 SYK 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SYK 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。

磷酸化 SYK 检测原理
总 SYK 双板检测方案
双板方案包括在裂解前将细胞培养在 96 孔板中，然后在添加总 SYK HTRF 检测试剂前将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 SYK 板检测方案
总 SYK 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 SYK 可在用于培养、刺激和裂解的单个板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

磷酸化与总 SYK 工作原理
检测验证
抗 IgM 刺激的 Ramos B 细胞中 SYK 的活化
将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系以每孔 100,000 个细胞的密度接种在半块 96 孔培养处理板中，每孔加入 20 µL 无胎牛血清的培养基。在 37°C、5% CO₂ 条件下过夜孵育后，用 10 µL 不同浓度递增的抗人 IgM 抗体刺激细胞 10 分钟，然后在室温下用 10 µL 补充的裂解缓冲液 #3（4X）温和振荡裂解 30 分钟。在检测步骤中，将 16 µL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

抗人 IgM 抗体诱导 Tyr525/526 处 SYK 磷酸化呈剂量依赖性增加，而蛋白质的表达水平未发生变化，这表明细胞表面的 BCR 复合物被激活。

总 SYK 检测验证
经 P505 - 15 处理的巨噬细胞分化的 THP - 1 细胞中 SYK 的抑制
将人单核细胞 THP - 1 细胞系以每孔 200,000 个细胞的密度接种在 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下用 100 ng/mL PMA 孵育 24 小时，使其分化为巨噬细胞。分化后，先用不同剂量递增的 SYK 抑制剂 P505 - 15 处理细胞 1 小时，然后用 250 µM 过钒酸盐处理 10 分钟。处理后，在室温下用 50 µL 补充的裂解缓冲液 #3（1X）温和振荡裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 细胞裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，SYK 抑制剂 P505 - 15 诱导 Tyr525/526 处 SYK 磷酸化呈剂量依赖性降低，而该激酶的表达水平不受处理的调节。

总 SYK 检测验证
HTRF 总 SYK 检测与蛋白质印迹法的比较
将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系在 T175 培养瓶中的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂ 条件下培养 48 小时。离心后，沉淀的细胞用 20 µg/mL 的抗人 IgM 抗体刺激 10 分钟，再离心后，在室温下用 10 mL 补充的裂解缓冲液 #3（1X）温和振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将每一种稀释液的 16 µL 转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 SYK 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的并列比较。

使用 HTRF 总 SYK 检测，每孔 500 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 2,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 SYK 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 4 倍。

总 SYK 检测验证
简化通路
SYK 信号传导的简化通路
SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中起着关键作用，尤其在免疫细胞中，如 B 细胞和小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）。

当 B 细胞或 TREM2/DAP12 受体复合物受到刺激时，SYK 分别与 CD79 亚基或 DAP12 的胞质结构域相互作用，通过结合它们特定的磷酸化受体基序（称为 “p - ITAMs”）。这导致 SYK 通过其催化结构域在 Tyr525/526 处的自身磷酸化而被激活。反过来，SYK 磷酸化下游底物（如 BTK），触发多种信号通路的激活和细胞反应，包括细胞活化、增殖和存活。

磷酸化通路与总 SYK 试剂盒

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
总蛋白
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸蛋白
靶标物种
人
技术
时间分辨荧光共振能量转移
治疗领域
神经科学
肿瘤学与炎症
单位规格
50,000 个检测点

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货号：64SYKTPEY

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