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HTRF TBK1 P-S172 KIT - 500 PTS 磷酸化TBK1检测试剂盒 - 500测试

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概述

磷酸化 TBK1 细胞检测试剂盒可便捷、准确地定量 Ser172 位点磷酸化的 TBK1（TANK 结合激酶 1）。在病原体感染后，细菌脂多糖（LPS）和病原体核酸可激活 TBK1，而这两种物质会进一步触发 TLR3/4（ Toll 样受体 3/4）和 cGAS-STING（环 GMP-AMP 合成酶 - 干扰素基因刺激蛋白）信号轴的激活。该磷酸化 TBK1 检测试剂盒适用于从基础研究到临床前药物研发的各个阶段，且包含实验所需的全部试剂。与酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（WB）相比，其检测通量更高。

作用原理

磷酸化 TBK1（Ser172）检测原理

磷酸化 TBK1（Ser172）检测可对 Ser172 位点磷酸化的 TBK1 进行定量分析。与蛋白质印迹法（WB）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜。磷酸化 TBK1（Ser172）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。其中，第一种抗体可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则可识别蛋白质本身（与蛋白质是否磷酸化无关）。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度呈直接正相关，且可在免洗涤检测模式下评估蛋白质的磷酸化状态。

（标注：Phospho tbk1 assay principle，即 “磷酸化 TBK1（Ser172）检测原理示意图”）

磷酸化 TBK1（Ser172）双板检测方案

双板检测方案的操作流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，随后对细胞进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 TBK1（Ser172）HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案可同时监测细胞的活力与汇合度。

（标注：Phospho tbk1 2 plate assay protocol，即 “磷酸化 TBK1（Ser172）双板检测方案流程示意图”）

磷酸化 TBK1（Ser172）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Ser172 位点磷酸化的 TBK1 时，可在同一块培养板中完成细胞培养、刺激与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持 HTRF 技术的高稳定性。

（标注：Tbk1 plate assay protocol，即 “磷酸化 TBK1（Ser172）单板检测方案流程示意图”）

检测验证

分析 TBK1 磷酸化水平以监测库普弗细胞中 LPS/TLR4 轴的活性

将小鼠库普弗细胞（ImKC 细胞系）接种到 96 孔板中（每孔 20 万个细胞），使用完全培养基培养，并在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育。次日，用含不同浓度 LPS（脂多糖）的无血清培养基处理细胞 1 小时。移除培养基后，加入 50 微升（μL）补充型 4 号裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；随后将 16 微升裂解液分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。结果显示，LPS 可诱导 TLR4 信号激活，使 Ser172 位点的 TBK1 磷酸化水平提升 3 倍；而 TBK1 激酶的表达水平保持稳定，表明 LPS 未产生细胞毒性作用。

（标注：Assay validation tbk1 phospho，即 “库普弗细胞中 LPS/TLR4 轴调控 TBK1 磷酸化检测结果图”）

分析 TBK1 磷酸化水平以监测 cGAS-STING 通路的激活

将小鼠库普弗细胞（ImKC 细胞系）接种到 96 孔板中（每孔 20 万个细胞），使用完全培养基培养，并在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育。次日，用含不同浓度 23-cGAMP（环 GMP-AMP）的无血清培养基处理细胞 1 小时。移除培养基后，加入 50 微升补充型 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；随后将 16 微升裂解液分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。结果显示，用 23-cGAMP 处理细胞可激活 STING，进而使 Ser172 位点的 TBK1 磷酸化水平提升 3.6 倍；与预期一致，TBK1 激酶的表达水平保持稳定。

（标注：Assay validation tbk1 phospho，即 “cGAS-STING 通路调控 TBK1 磷酸化检测结果图”）

HTRF 磷酸化 TBK1 与总 TBK1 细胞检测试剂盒与蛋白质印迹法（WB）的对比

将人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 2 天，直至细胞汇合度达到 90%。随后用 200 纳摩尔（nM）的花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟，再加入 3 毫升补充型 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液，用补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释；将 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。取等量裂解液进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法（WB）的平行对比。结果显示：使用 HTRF 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 试剂盒时，每孔仅需 1250 个细胞即可检测到显著信号；而使用蛋白质印迹法时，需 2500 个细胞才能检测到最低的化学发光（ECL）信号。因此，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

（标注：assay validation、Tbk1 phospho s172 4，即 “HTRF 与 WB 检测 TBK1 对比结果图”）

简化通路

TLR3/4 与 cGAS-STING 简化通路

TBK1（TANK 结合激酶 1，又称 NAK）是一种多聚体激酶，可通过 Ser172 位点的自磷酸化被激活。该激酶是连接多条炎症通路与自噬通路的关键信号节点。在病原体感染后，细菌脂多糖（LPS）和病原体核酸可激活 TBK1，而这两种物质会进一步触发 TLR3/4 和 cGAS-STING 信号轴的激活：

当 LPS 与细胞表面的 TLR4 结合后，TLR4 会转移至内体并招募 TRAM（TRIF 相关接头分子）蛋白，TRAM 进而激活 TRIF（TIR 结构域包含的接头诱导干扰素 -β）蛋白；
同样地，进入细胞的双链 RNA（dsRNA）会与内体中的 TLR3 结合，直接激活 TRIF；
对于双链 DNA（dsDNA），其进入细胞后会与胞质中的传感器 cGAS（环 GMP-AMP 合成酶）结合，诱导 23-cGAMP（环 GMP-AMP）的产生，23-cGAMP 进而激活接头蛋白 STING（干扰素基因刺激蛋白）。

上述每条通路被激活后，TBK1 会被招募到不同的信号复合物中，并通过 Ser172 位点的自磷酸化被激活。激活后的 TBK1 会进一步激活转录因子 IRF3（干扰素调节因子 3），IRF3 转移至细胞核内并诱导 I 型干扰素基因的表达，最终引发炎症反应。此外，TBK1 还参与自噬过程：它可直接磷酸化自噬受体视神经萎缩蛋白（optineurin）和 p62 蛋白，这些受体将蛋白质 cargo（待降解物质）靶向运送到自噬体中。

（标注：Phospho pathway tbk1 64tbk，即 “TLR3/4 与 cGAS-STING 调控 TBK1 的通路简化示意图”）

规格参数

应用领域（Application）：细胞信号传导（Cell Signaling）
品牌（Brand）：HTRF
检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：磷酸化（Phosphorylation）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）、小鼠（Mouse）
技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域（Therapeutic Area）：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格（Unit Size）：500 个检测点（500 assay points）

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