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HTRF (H/M) TDP43 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）是一种参与 RNA 相关代谢的核酸结合蛋白。聚集的 TDP-43 已被确定为肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTLD）的标志，并且在多种神经退行性疾病（即 TDP-43 蛋白病）中也广泛存在。在病理状态下（突变或失调），TDP-43 会在脑和脊髓神经元的细胞质中形成不溶性包涵体。TDP-43 磷酸化 Ser409/410 检测可检测细胞裂解物中人源磷酸化的 TDP-43。

工作原理

总 TDP-43 检测原理

HTRF 总 TDP-43 检测可定量细胞裂解物中 TDP-43 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 TDP-43 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 TDP-43 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式下，可用于评估该蛋白的表达水平。

总 TDP-43 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 TDP-43 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 TDP-43 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 TDP-43 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）调节磷酸化 TDP-43（Ser409/410）水平

将 Neuro2a 细胞在 96 孔板中培养（50,000 个细胞 / 孔）24 小时，然后用不同浓度的花萼海绵诱癌素 A（一种蛋白磷酸酶 1 和 2A 抑制剂）处理 30 分钟。处理后，按照悬浮细胞方案的描述，加入 10 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（4X），在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 TDP-43（Ser409/410）或总 TDP-43 检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，花萼海绵诱癌素 A 通过抑制 PP1/2，引发 Ser409/410 位点磷酸化 TDP-43 的剂量依赖性积累，而该蛋白的表达水平不受此处理的影响。

使用 CK1 抑制剂抑制磷酸化 TDP-43（Ser409/410）/ 总 TDP-43

将 Neuro2a 细胞在 96 孔板中培养（50,000 个细胞 / 孔）24 小时，然后用酪蛋白激酶 1（CK1）抑制剂 IC 261 或 PF 670462（100 µM）处理 1.5 小时，随后用花萼海绵诱癌素 A 激活（30 分钟，100 nM）。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 TDP-43（Ser409/410）或总 TDP-43 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，结果显示，经 CK1 抑制剂处理后，花萼海绵诱癌素 A 诱导的 TDP-43 Ser409/410 磷酸化受到抑制，而该蛋白的表达水平不受此处理的影响。

评估多种细胞系中总 TDP-43 的水平

将贴壁的人源和鼠源细胞（Neuro 2A、HeLa 和 SH-SY5Y）以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，加入 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 TDP-43 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 TDP-43 检测能有效检测多种人源和鼠源细胞模型中的总 TDP-43，且这些细胞模型的表达水平不同。

HTRF 总 TDP-43 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用花萼海绵诱癌素 A 处理细胞（30 分钟，100 nM），然后加入 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 TDP-43 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 TDP-43 检测时，每孔 1,000 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 4,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 TDP-43 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 4 倍。

简化通路

TDP-43 信号通路

TDP-43（TAR DNA 结合蛋白 43）是一种 DNA 和 RNA 结合蛋白，在 RNA 代谢中起着至关重要的作用。它主要位于细胞核内，在细胞核和细胞质之间穿梭。

TDP-43 的磷酸化受到调控，尽管在病理状态下这可能是一个异常过程。已知多种激酶（包括酪蛋白激酶（CK1 和 2）、tau 微管蛋白激酶（TTBK1 和 2）以及细胞分裂周期 7（CDC7））会促进 TDP-43 的磷酸化，而磷酸酶（PP1 和 2）和钙调磷酸酶则催化其去磷酸化。某些突变、氧化应激等因素导致这些过程失调，可能会使 TDP-43 的磷酸化水平升高。TDP-43 的磷酸化会影响 RNA 结合或选择性剪接等细胞功能，并导致其在细胞质中错误定位和积累，从而引发聚集体的形成。

在病理状态下，Ser409/410 位点磷酸化的 TDP-43 是肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）或阿尔茨海默病（AD）等蛋白病的标志。TDP-43 的异常磷酸化、细胞质积累和聚集会阻碍通过蛋白酶体和自噬机制的清除过程，从而导致神经元毒性。

TDP-43 的磷酸化及其调控可能为治疗神经退行性疾病提供新的治疗方向。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64TDPTPEY

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