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HTRF (H) XBP1 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

HTRF 人源 XBP1 检测试剂盒可同时检测剪切型 XBP1（XBP1s）和未剪切型 XBP1（XBP1u），用于检测不同细胞中内源性或过表达的总 XBP1（XBP1s + XBP1u）的表达情况。

当发生内质网应激及未折叠蛋白积累时，BiP 会解除其抑制性结合，从而激活 IRE1。IRE1 受体发生二聚化，随后自磷酸化，进而激活其核糖核酸酶活性。通过这一作用，IRE1 将 XBP1u mRNA 剪切为 XBP1s，使其能够进行翻译并转运至细胞核内。之后，XBP1s 发挥转录因子的作用。

工作原理

总 XBP1 检测原理

HTRF 人源总 XBP1 检测试剂盒可对细胞裂解物中 XBP1（XBP1u + XBP1s）的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全在孔板中进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人源总 XBP1 检测采用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 XBP1s 或 XBP1u 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用免洗形式，为评估蛋白质表达提供了便捷方式。

总 XBP1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，之后加入人源总 XBP1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 XBP1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测人源总 XBP1 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

总 XBP1 和 XBP1s 的药理学验证（激活剂）

将 Hep-G2 或 MCF7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。用不同浓度的毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂），然后加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟进行裂解。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 XBP1 和 XBP1s 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，毒胡萝卜素诱导了 XBP1s 形式的翻译，XBP1s 信号水平呈剂量依赖性增加。经此处理后，总 XBP1 信号也略有增加。

总 XBP1 检测的抑制剂药理学验证

将 MCF7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。用毒胡萝卜素（半数有效浓度 EC80：150 nM）和不同浓度的两种抑制剂（APY29 和 MKC3946）共同处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂），然后加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟进行裂解。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，毒胡萝卜素刺激诱导的轻微 HTRF 信号被 APY29 和 MKC3946 两种化合物抑制，其半数抑制浓度（IC50）分别为 1.1 µM 和 1.7 µM，这意味着总 XBP1 的表达量减少。

XBP1 检测的特异性

将 HAP1 细胞和 HAP1 XBP1 敲除（KO）细胞（来自 Horizon Discovery）在 T175 培养瓶中使用完全培养基培养 24 小时（37°C、5% CO₂）。加入 3 mL 补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟，然后将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 XBP1 敲除细胞中未检测到信号，而在 HAP1 野生型（wt）细胞中检测到了信号，这证明该检测对 XBP1 蛋白具有特异性。

不同细胞系中总 XBP1 的检测

将贴壁的人源和鼠源 HAP1、MCF7 和 Hep-G2 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用毒胡萝卜素在 37°C 条件下处理细胞 4 小时。然后用补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 XBP1 检测能有效检测不同细胞模型中的 XBP1 蛋白（XBP1s + XBP1u），这些细胞模型中该蛋白的表达水平各不相同。

HTRF 总 XBP1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中使用完全培养基培养 24 小时（37°C、5% CO₂）。用 700 nM 毒胡萝卜素处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）后，加入 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟进行裂解。

使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 XBP1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

简化通路

XBP1 通路

XBP1 是调节细胞存活的未折叠蛋白反应（UPR）的关键组成部分。未折叠蛋白反应涉及三条通路，分别由不同的介质（如 ATF6、IRE1 和 PERK）参与，并产生显著的下游效应。

当发生内质网应激及未折叠蛋白积累时，BiP 会解除对三种内质网应激蛋白的抑制性结合并激活它们。

IRE1 被激活后，首先发生二聚化，随后自磷酸化，从而激活其核糖核酸酶活性。通过这一作用，IRE1 将 XBP1u mRNA 剪切为 XBP1s，使其能够进行翻译并转运至细胞核内。之后，XBP1s 发挥转录因子的作用。

规格参数

其他规格	详情
应用	细胞信号传导
品牌	HTRF
检测方式	HTRF
兼容的裂解缓冲液	裂解缓冲液 1 裂解缓冲液 2 裂解缓冲液 4
分子修饰	总（Total）
产品类别	试剂盒（Kit）
样品体积	16 µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷蛋白
靶标物种	人
技术	时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格	500 个检测点

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货号：64XBPTPEY

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