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HTRF YAP TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

基于细胞的总 YAP 检测旨在监测 YAP 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它使用与我们的磷酸化 YAP 试剂盒相同的缓冲液，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 Hippo-YAP 通路。YAP 作为 Hippo 通路中的核心介导因子，是肿瘤疾病研究的重要靶标。

工作原理

总 YAP 检测原理
总 YAP 检测用于定量细胞裂解物中 YAP 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 YAP 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 YAP 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无洗涤形式，为评估蛋白质的表达提供了途径。

phospho-how-it-works-total-yap-assay-principle
总 YAP 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再添加总 YAP HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 YAP 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 YAP 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

phospho-how-it-works-total-yap-1-plate-assay-protocol

检测验证

HTRF 总 YAP 检测与多种细胞系的兼容性
将人源细胞（HEK293、HEK293A、U-2 OS、HeLa、乳腺癌细胞、MCF 10A）和鼠源细胞（NIH 3T3）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用无血清细胞培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。随后移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色小体积微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 YAP Ser127 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

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基于总 YAP 细胞检测的 HTRF 检测与蛋白质印迹法对比
人乳腺癌细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时。移除培养基后，加入 3 mL 补充的裂解缓冲液，在室温下裂解 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性组分，用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，然后取 16 µL 各稀释液，分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 检测进行平行分析。HTRF 总 YAP 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。使用 HTRF 检测时，2,000 个细胞就足以检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能产生信号。

assay-validation-yap-total
血清刺激对总 YAP 的动力学影响
将 100,000 个 HEK293A 细胞接种到 96 孔板中，使用无血清细胞培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。加入血清并分别刺激不同时间。移除细胞培养基后，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色小体积微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 YAP 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。血清处理过夜才能获得最佳量的总 YAP 蛋白。

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简化通路

Hippo-YAP 细胞信号激活通路
Hippo/YAP 通路通过调控细胞增殖与凋亡的平衡来调节器官大小，还参与机械信号和细胞骨架信号的转导。该通路可被多种刺激激活，如细胞黏附、高细胞密度、机械张力或缺乏生长因子等。通路激活后，首先激活 MTS 激酶，进而磷酸化 Lats 激酶。随后，YAP 在丝氨酸 127 位点被磷酸化，导致其滞留于细胞质中，最终被蛋白酶体降解。因此，磷酸化的 YAP 代表该蛋白质的失活形式。已有报道称，在某些类型的癌症（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌）中存在 YAP/TAZ 突变。

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Hippo-YAP 细胞信号失活通路
Hippo/YAP 通路通过调控细胞增殖与凋亡的平衡来调节器官大小，此外还参与机械信号和细胞骨架信号的转导。当 Hippo/YAP 通路失活时，YAP/TAZ 在细胞核内积累，并诱导细胞增殖相关基因的转录。除了其自身特性和致癌潜力外，Hippo/Yap 通路中的某些突变会导致过度生长表型，这在器官大小上可体现出来。最后，Hippo/yap 通路的失调会赋予癌细胞自我再生的特性（Cordenonsi 等人，《细胞》2011 年；Pan D 等人，《基因与发育》2007 年；Pan D 等人，《发育细胞》2010 年）。

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规格

其他规格
应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化（NASH/Fibrosis）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64YATPEH

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