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HTRF (H) FLT3 P-Y589/591 KIT - 10K PTS

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概述

HTRF 磷酸化酪氨酸 589/591 人 FLT3（Fms 样酪氨酸激酶 3，又称 FLK2）检测法可监测多种细胞中野生型 FLT3（FLT3 WT）和 / 或内部串联重复（ITD）FLT3 突变体在酪氨酸 589/591 位点的磷酸化情况。FLT3 是 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化，并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，进而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致免疫细胞无序增殖、未成熟化以及致癌表型的出现。FLT3 是急性髓系白血病（AML）中最常见的突变基因。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性持续激活，或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体在 AML 中的作用已广为人知。因此，FLT3 突变体已成为制药行业重要的药物靶点。

工作原理

磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）检测原理

磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）检测用于测定在酪氨酸 589 和 591 位点发生磷酸化的 FLT3。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 FLT3 Tyr589/591 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FLT3 Tyr589/591 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

FLT3-L 处理对磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）的药理学调节

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞和 THP1 细胞分别以 250,000 个 / 孔和 500,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用浓度递增的 FLT3 配体（FLT3-L）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。随后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591、磷酸化 FLT3 Tyr 842 或总 FLT3 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。对于磷酸化 Tyr 842 检测，可通过过夜孵育增强信号。

正如预期，FLT3-L 诱导 FLT3 发生二聚化，同时酪氨酸 589、591 和 842 位点的磷酸化水平呈剂量依赖性增加，而 FLT3 总蛋白的表达水平未受影响。

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使用 HTRF 磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）和总 FLT3 检测抑制剂对 BaF3 ITD 和 MV4-11 细胞的作用

将稳定表达 FLT3-ITD 的 Ba/F3 细胞和表达 FLT3-ITD 的 MV4-11 细胞以 250,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用浓度递增的奎扎替尼（Quizartinib）和米哚妥林（Midaustaurin）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后移除培养基，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591 和总 FLT3 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

奎扎替尼和米哚妥林的半数抑制浓度（IC50）分别测得为 1.5 ng/mL 和 10 ng/mL。

这两种化合物均未影响 FLT3 总蛋白的表达水平。

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磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）检测的特异性

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞以 250,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。在存在或不存在 1µM 包含酪氨酸 589 和 591 磷酸化位点的磷酸化肽段的情况下，用高浓度 FLT3 配体（FLT3-L）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。随后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期，磷酸化肽段与 FLT3 受体的磷酸化位点竞争结合，导致信号完全消失。这证明了该检测的特异性。

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HTRF 磷酸化 FLT3（Tyr 589/591）检测与蛋白质印迹法的比较

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。用 0.5 µg/mL 的 FLT3 配体在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。

移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

用补充的 1X 裂解缓冲液 #4 对细胞裂解物进行系列稀释，然后将 16µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591 检测试剂。过夜孵育后记录信号。

取等量的裂解物上样到凝胶中，用于 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 16 倍。

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简化通路

FLT3 受体信号通路

FLT3 是 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化，并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，进而调控免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致细胞无序增殖、免疫细胞未成熟以及致癌表型的出现。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性持续激活，或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体无需 FLT3L 即可激活其下游通路。FLT3 在白血病（尤其是急性髓系白血病，AML）的发生发展中具有重要作用。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64FLT3Y1PEH

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