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HTRF (H/M) RBM39 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

RNA 结合基序蛋白 39（RBM39）是一种前体 mRNA 剪接因子，参与转录调控、选择性剪接、蛋白质翻译等多种生物学过程。RBM39 的上调可通过调控多种肿瘤相关基因的转录、蛋白质翻译及选择性剪接，间接参与肿瘤的生长与进展；而对 RBM39 的抑制对肺癌、乳腺癌、结直肠癌等多种癌症具有杀伤作用。基于这些特性，RBM39 蛋白已成为癌症诊断与治疗领域的新兴靶点。

工作原理

RBM39 总蛋白检测原理

RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光（HTRF）检测可对细胞裂解液中 RBM39 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

RBM39 总蛋白检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 RBM39 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 RBM39 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 RBM39 蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估 RBM39 蛋白的表达水平。

phospho-how-it-works-rbm39-total-assay-principle（图示：RBM39 总蛋白检测原理）

RBM39 总蛋白双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入 RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-rbm39-total-assay-protocol-01.svg（图示：RBM39 总蛋白双板检测方案）

RBM39 总蛋白单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测 RBM39 总蛋白时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-how-it-works-rbm39-total-assay-protocol-02（图示：RBM39 总蛋白单板检测方案）

检测验证

利用 RBM39 总蛋白与 α- 微管蛋白检测试剂盒分析吲地司坦（Indisulam）的作用效果

将 HeLa 细胞以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用剂量递增的吲地司坦处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 6 小时。之后移除培养基，加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

同时，取 4 微升细胞裂解液（原液或用补充后的裂解缓冲液预稀释）转移至小体积白色微孔板。进行均相时间分辨荧光检测时，先加入 12 微升试剂盒稀释液，再加入 4 微升预混合的 α- 微管蛋白均相时间分辨荧光检测抗体。在室温下孵育过夜后，同样记录均相时间分辨荧光信号。

抗癌药物吲地司坦可通过诱导 RBM39 降解抑制细胞增殖。结果显示：随着吲地司坦浓度升高，RBM39 信号逐渐降低，而 α- 微管蛋白信号保持稳定，这表明 RBM39 信号降低是由其降解所致。

assay-validation-rbm39-pharmaco-1（图示：RBM39 药物验证 1）

RBM39 总蛋白检测的特异性验证

将 HeLa 细胞以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。

在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，用 25 纳摩尔的 ON-TARGETplus 小干扰 RNA（购自 Horizon Discovery）处理细胞，该小干扰 RNA 可特异性靶向 RBM39；同时设置非靶向小干扰 RNA 处理组作为对照。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，更换为完全培养基，随后在 37°C 条件下继续孵育 24 小时。

孵育结束后，用 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液（1 倍浓度）裂解细胞。将细胞裂解液稀释 2 倍后，取 16 微升转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升预混合的 RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：用 RBM39 小干扰 RNA 处理的细胞，其 RBM39 总蛋白信号显著下调，与非靶向小干扰 RNA 转染组相比，信号降低 62%，这证明了该试剂盒的特异性。

assay-validation-rbm39-pharmaco-2（图示：RBM39 药物验证 2）

RBM39 均相时间分辨荧光检测对人源和鼠源细胞系的兼容性验证

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养至融合状态。移除培养基后，加入 3 毫升补充后的 4 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

将 NIH/3T3 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养至融合状态。移除培养基后，加入 3 毫升补充后的 4 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的 4 号裂解缓冲液（1 倍浓度）对两种细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升样本原液及各稀释度样本转移至 384 孔小体积微孔板，加入 4 微升 RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。孵育过夜后，记录信号。

结果显示：RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测可检测鼠源 RBM39，且与检测人源样本相比，具有良好的信背比。

assay-validation-rbm39-pharmaco-4（图示：RBM39 药物验证 4）

RBM39 均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

用补充后的 4 号裂解缓冲液（1 倍浓度）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升样本原液及各稀释度样本转移至 384 孔小体积微孔板，加入 4 微升 RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。孵育过夜后，记录信号。

取等量裂解液上样至凝胶，通过蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法进行平行对比检测。

结果显示：在此实验条件下，RBM39 总蛋白均相时间分辨荧光检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 8 倍。

assay-validation-rbm39-pharmaco-4（图示：RBM39 药物验证 4）

简化通路

RBM39 信号通路简化图

RNA 结合基序蛋白 39（RBM39）是一种 RNA 结合蛋白，参与转录共调控与 RNA 选择性剪接过程。近期研究表明，RBM39 是剪接抑制剂磺酰胺类化合物（SPLAMs，如吲地司坦）的作用靶点，这类化合物可作为 “分子胶”，介导 RBM39 与 DCAF15 相关 E3 泛素连接酶复合物结合。该结合过程会导致 RBM39 发生泛素化，并被蛋白酶体选择性降解。

RBM39 的缺失会引发 RNA 异常剪接事件与基因表达差异，这一过程可抑制细胞周期进展，并在多种临床前模型中实现肿瘤消退 —— 因为 RBM39 对癌细胞存活至关重要。这些特性使 RBM39 成为癌症治疗干预领域的潜在靶点。

pathway-rbm39（图示：RBM39 信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 次检测

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货号：64RBM39TPEG

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