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HTRF B-ARR2 RECRUITMENT KIT - 1K PTS 贝塔抑制蛋白2招募试剂盒-1,000测试

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概述

β- 抑制蛋白 2（B-arr2）募集细胞检测可监测通过 G 蛋白偶联受体（GPCR）激活引起的 β- 抑制蛋白 2 和衔接蛋白 2（AP2）的募集。B-arr2 募集试剂盒通过监测内源性 β- 抑制蛋白 2 与其搭档 AP2 之间的相互作用，用于表征化合物对 β- 抑制蛋白信号通路的影响。

文献表明，在 GPCR 背景下研究 β- 抑制蛋白信号通路时，对这种相互作用的药理学研究具有重要意义。

工作原理

B-arr2 募集试剂盒检测原理

B-arr2 募集检测可监测细胞中由 GPCR 激活介导的 β- 抑制蛋白 2 的募集。Revvity 的 B-arr2 募集试剂盒灵敏度高，能够对涉及内源性 β- 抑制蛋白 2 和 AP2 蛋白的化合物进行药理学表征。该试剂盒使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对 β- 抑制蛋白 2 和 AP2 具有高度特异性。当细胞中存在 β- 抑制蛋白 2 与 AP2 的相互作用时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中 β- 抑制蛋白 2/AP2 复合物的数量直接成正比。

B-arr2 募集检测方案（选项 1）

使用 HTRF 试剂检测 B-arr2 募集可在单个培养板中完成，该培养板用于细胞培养、刺激、稳定和检测。稳定步骤后需要进行三次洗涤。此特定方案可在室温下孵育过夜后，对未裂解的细胞和内源性蛋白进行检测，同时保持稳定的 HTRF 质量。

B-arr2 募集检测方案（选项 2）

使用 HTRF 试剂检测 B-arr2 募集可在单个培养板中完成，该培养板用于细胞培养、刺激、稳定和检测。稳定步骤后需要进行三次洗涤。此特定方案可对未裂解的细胞和内源性蛋白进行检测，在室温下孵育过夜后仍能保持稳定的 HTRF 质量。

B-arr2 募集检测方案的选项 2 通过在室温下孵育过夜后移除 80µL 检测试剂，可提高信噪比（S/B）。

检测验证

以两种 GPCR 上的激动剂和拮抗剂表征为例
将 Tag-lite SNAP-β2 肾上腺素受体（Beta2R）和 SNAP - 血管加压素 V1A 受体（V1AR）HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。随后，在室温下分别用浓度递增的血管加压素（V1AR）和异丙肾上腺素（Beta2R）（稀释于刺激缓冲液 4 中）处理 5 分钟（血管加压素 V1A 受体）和 30 分钟（β2 肾上腺素受体）。接下来移除培养基，用 30µL 稳定缓冲液 1 在室温下稳定细胞 15 分钟，然后用 100µL 洗涤缓冲液 1 洗涤 3 次。最后，加入 100µL B-arr2 募集检测试剂，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

按照类似方案表征拮抗剂化合物：在室温下加入浓度递增的 SR 49059（V1AR）和 ICI-118,551（Beta2R）处理 30 分钟，然后加入 15nM 血管加压素和 40nM 异丙肾上腺素作为激动剂化合物。

HEK293 细胞中 β2 肾上腺素受体上药理学化合物的排名

将 Tag-lite SNAP-β2 肾上腺素受体 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。在室温下用浓度递增的一组激动剂化合物（稀释于刺激缓冲液 4 中）处理 30 分钟后，移除培养基。用 30µL 稳定缓冲液 1 在室温下稳定细胞 15 分钟，然后用 100µL 洗涤缓冲液 1 洗涤 3 次。最后，加入 100µL B-arr2 募集检测试剂，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

按照类似方案表征一组拮抗剂化合物：在室温下加入浓度递增的拮抗剂处理 30 分钟，然后加入 30nM 异丙肾上腺素。

检测方案选项 1 与选项 2 的检测结果比较

将 Tag-lite SNAP - 胰高血糖素样肽 1 受体（GLP1R）HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。在室温下用浓度递增的艾塞那肽 - 4（稀释于刺激缓冲液 4 中）处理 30 分钟后，移除培养基。用 30µL 稳定缓冲液 1 在室温下稳定细胞 15 分钟，然后用 100µL 洗涤缓冲液 1 洗涤 3 次。最后，加入 100µL B-arr2 募集检测试剂，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号（检测方案选项 1）。

在过夜孵育后增加一个步骤，即移除 80µL 检测试剂（检测方案选项 2）。使用与检测方案选项 1 相同的读板仪设置记录增强的 HTRF 信号。

简化通路

简化的 GPCR 信号通路

β- 抑制蛋白在 GPCR 信号通路中发挥核心作用，通过调节激动剂介导的 GPCR 信号传导实现其功能。它们的作用包括介导受体脱敏和再敏化过程、作为 MAPK 通路（如 MAPK1/3 或 AKT1）的信号支架，以及参与泛素蛋白连接酶向受体的募集。β- 抑制蛋白作为多价衔接蛋白，可将 GPCR 从 G 蛋白信号模式（从质膜传递短期信号）转换为 β- 抑制蛋白信号模式，这种模式传递一组不同的信号，始于受体内化并通过细胞内区室转运。

在 GPCR 脱敏过程中，β- 抑制蛋白与 GRK 磷酸化的受体结合，并在空间上阻止其与 G 蛋白偶联。

然后，β- 抑制蛋白通过与 AP2 复合物的 β- 衔接蛋白亚基相互作用，将许多受体靶向到网格蛋白包被的小窝中进行内化，从而将 GPCR 募集到多组分复合物中。β- 抑制蛋白与 AP2 之间的相互作用是激动剂刺激后 GPCR 定位于网格蛋白包被小窝的核心初始步骤，因此针对这种相互作用的药理学化合物具有相当大的研究价值。

内化的抑制蛋白 - 受体复合物转运到细胞内的内体中。

受体再敏化需要移除受体结合的抑制蛋白，以便受体可以去磷酸化并返回质膜。β- 抑制蛋白的参与程度似乎因受体、激动剂和细胞类型的不同而有显著差异。

规格参数

其他规格参数

应用：第二信使检测
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
产品类别：试剂盒
样品体积：200µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：G 蛋白偶联受体（GPCR）
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、传染病、炎症、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤与炎症、罕见病
单位规格：1,000 个检测点

没有数据

货号：62BDBAR2PEB

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