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HTRF AP2 TOTAL KIT - 100K PTS

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概述

总 AP2 细胞检测法可监测总 AP2β（衔接蛋白 2β）的水平，用于检测各类细胞中内源性或过表达的 AP2β 的表达情况。AP2β 是衔接蛋白复合物 2（AP-2）的组成部分，已知其可作为货物蛋白（cargo proteins）发挥作用。它们在细胞中承担多种功能，包括通过与 β- 抑制蛋白（β-arrestins）直接相互作用，经由网格蛋白依赖性内吞作用（clathrin-dependent endocytosis process）实现 G 蛋白偶联受体（GPCRs）的内化。AP2β 的异常会导致细胞对激素、神经递质或感觉信号等刺激的反应出现特异性减弱。由于 AP2 在多种组织中均有表达，研究认为 AP2 可能通过影响受体介导的信号传导，在多种癌症或其他人类疾病（如糖尿病）中发挥重要作用。

工作原理

总 AP2 检测原理

总 AP2 检测法可对细胞裂解液中 AP2β 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测法完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。
总 AP2 检测法使用两种标记抗体：一种与供体荧光团（donor fluorophore）偶联，另一种与受体荧光团（acceptor）偶联。两种抗体均对 AP2β 蛋白上的特定表位（distinct epitope）具有高度特异性。当细胞提取物中存在 AP2β 时，加入上述偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会相互靠近，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中 AP2β 蛋白的浓度呈直接正相关，且该检测采用 “无需洗涤”（no-wash）的检测形式，为评估蛋白表达水平提供了便捷手段。

总 AP2 双板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 AP2 时，可在同一块微孔板上完成细胞培养、刺激和裂解步骤，无需洗涤操作。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

总 AP2 单板检测方案

检测验证

HTRF 总 AP2 检测法与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将人胚肾 293 细胞（HEK293）置于含完全培养基的 T175 培养瓶中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下培养。孵育 72 小时后，加入 3 毫升 4 号裂解缓冲液（1×），在室温（RT）下轻轻振荡，使细胞裂解 30 分钟。使用裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 13 微升各稀释度的裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 3 微升裂解缓冲液和 4 微升 HTRF 总 AP2 检测试剂。
取等量裂解液，采用 HTRF 检测法与蛋白质印迹法进行平行对比实验。结果显示，至少在本实验条件下，HTRF 检测法的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

HTRF 总 AP2 检测法的物种兼容性

将人源细胞（HEK293）、仓鼠源细胞（CHO-K1）和鼠源细胞（NIH3T3）以每孔 10 万个细胞的密度接种到含细胞培养基的 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。随后移除培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡，使细胞裂解 30 分钟。取 16 微升裂解液转移至 384 孔半体积（sv）白色微孔板中，并加入 4 微升 HTRF 总 AP2 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后，记录 HTRF 信号。
检测得到的 AP2 表达水平与文献报道数据及采用相同细胞进行的实时定量聚合酶链反应（qPCR）实验结果具有良好的相关性。

简化通路

GPCR 信号传导简化通路及 AP2 的作用

β- 抑制蛋白（β-arrestins）在 GPCR 信号通路中发挥核心作用，可调控激动剂介导的 GPCR 信号传导。在 β- 抑制蛋白的多种功能中，其既能介导受体的脱敏（desensitization）与复敏（resensitization）过程，又能作为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（如 MAPK1/3 或 AKT1 通路）的信号支架，还参与泛素 - 蛋白连接酶向受体的募集过程。
β- 抑制蛋白作为多价衔接蛋白，可将 GPCR 的信号传导模式从 “G 蛋白依赖模式”（该模式从细胞膜传递短时效信号）转换为 “β- 抑制蛋白依赖模式”—— 后者的信号传导始于受体内化并进入细胞内区室，传递的信号组与前者完全不同。

规格参数

项目	规格描述
应用领域（Application）	细胞信号传导（Cell Signaling）
品牌（Brand）	HTRF
检测方式（Detection Modality）	HTRF
分子修饰类型（Molecular Modification）	总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）	试剂盒（Kit）
样品体积（Sample Volume）	16 微升（µL）
运输条件（Shipping Conditions）	干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶标类别（Target Class）	磷蛋白（Phosphoproteins）
靶标物种（Target Species）	人（Human）、小鼠（Mouse）
技术原理（Technology）	时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域（Therapeutic Area）	心血管疾病（Cardiovascular）、炎症（Inflammation）、代谢 / 糖尿病（Metabolism/Diabetes）、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化（NASH/Fibrosis）
单位规格（Unit Size）	1000 个检测点（1,000 assay points）

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货号：64AP2TPEJ

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