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HTRF助力T细胞治疗EGF/EGFR和IL-6/IL-6R信号通路研究

2025年03月03日

T细胞治疗近年来一直是对抗癌症的中心焦点。大量基于T细胞的免疫疗法显示出中等到良好的效果，特别是在血液瘤方面。著名的CAR-Ts，其中T细胞通过TAA和T细胞表面抗原的结合被重定向到肿瘤细胞，从而增强肿瘤溶解并将T细胞重定向到肿瘤微环境。虽然双特异性T细胞结合体的突破得到了监管批准，但它们都有缺点。细胞因子释放过度，最终导致细胞因子释放综合征(CRS)，是T细胞免疫疗法观察到的最严重的不良反应之一。

虽然CRS的病理生理机制尚不完全清楚，但已知白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL- 10)和干扰素-γ (IFNγ)是CRS的主要驱动因素。

本篇文章是由德国达姆施塔特工业大学有机化学与生物化学研究所和瑞士埃帕林生物制品创新中心合作发表于Frontiers in Immunology。作者提出了一种减毒的三特异性T细胞结合器(TCE)方案，结合抗白细胞介素6受体(IL-6R)结合片段，以调节细胞因子活性(TriTECM)。通过同时靶向两种肿瘤相关抗原，表皮生长因子受体(EGFR)和程序性死亡配体1(PD-L1)，以及双特异性二合一抗体，实现了高肿瘤选择性和检查点抑制。作者生成了包含额外CD3-和IL-6R结合模块的四功能分子。观察到配体对PD-L1和IL-6R的竞争以及对EGF-和IL-6介导的信号通路的抑制。此外，TriTECM分子能够激活T细胞，并通过CD3结合以减弱的方式触发T细胞介导的细胞毒性。与缺乏IL-6R结合的对照相比，在T细胞活化后，TriTECM分子的促炎细胞因子干扰素γ (IFNγ)减少，提示通过IL-6R成功衰减和潜在调节。由于IL-6在细胞因子释放综合征中起关键作用，并与肿瘤进展有关，因此这种分子设计可以减少先前TCEs观察到的副作用和细胞毒性，并扩大其治疗窗口。

作者首先做了细胞培养、抗体构建体的克隆、生产和纯化、生物物理表征(SDS-PAGE，热稳定性)来表征生产纯化的抗体，生物层干涉法(BLI)测定抗体亲和力等研究，对于信号通路EGF/EGFR 和IL-6/IL-6R的研究采用HTRF(cisbio)试剂盒检测磷酸化蛋白和信号抑制作用。作者将5×104个A549细胞/孔接种到96孔组织培养板上，并让其贴壁培养4小时，细胞随后血清饥饿过夜。将血清饥饿的细胞用所需的抗体浓度预处理1小时，然后对EGF和IL-6添加20ng/ml配体分别处理10和40min。随后用PBS洗涤细胞，并用适当的裂解缓冲液裂解。使用Phospho-Akt(Ser4739)细胞HTRF试剂盒(cisbio)对EGF/EGFR通路进行研究，使用Phospho-STAT3 (Tyr705)细胞HTRF试剂盒(cisbio)对IL-6/IL- 6R通路进行研究。最后通过多功能酶标仪EnVision(Revvity)进行上机检测。使用GraphPad Prism8.0.1绘制数据图表。测定至少重复三次，具有生物重复性。除此之外作者还做了还有T细胞活化试验、PBMC分离、细胞因子释放试验、T细胞介导的细胞毒性等一系列实验，感兴趣的读者可以详读文献。

为了获得充分的治疗效果，与EGFR、PD-L1和IL-6R结合的抗体具有拮抗作用是很重要的。众所周知，Sarilumab与IL-6R上的IL-6结合位点竞争，而作者鉴定的亲本K+H抗体与PD-1竞争以结合PD-L1。通过BLI，对TriTECM分子和全长sarilumab或K+H作为对照进行竞争分析。对于IL-6/IL-6R竞争，(αCD3ε)K(IL-6R)+H(IL-6R)结构同样受到抑制。

然而，与沙伐单抗IL-6R结合和配体竞争相比，K(αCD3ε) +H(IL-6R)表现出较弱的竞争(图3A)。这可能是由于单价IL-6R结合，而沙伐单抗和(αCD3ε)K(IL-6R)+H(IL-6R)都是二价的。对于PD-L1，所有抗体都与PD-L1表现出良好的结合，与PD-1预孵育后，PD-L1的结合减弱，证实了结合的竞争(图3B)。 

由于亲本K+H抗体结合到EGFR的II结构域，它不与其配体EGF竞争。然而，它仍然抑制EGF介导的信号通路。同样，sarilumab能够抑制IL-6介导的信号传导。因此，分别测定了pAKT和pSTAT3对EGF-和IL-6介导的信号传导抑制作用。对于IL-6/IL-6R, HTRF检测的pSTAT3分析显示，TriTECMs和K(IL-6R)+H(IL-6R)对照单抗均具有剂量依赖性抑制作用(图3C)。虽然300 nM的(αCD3ε)K+ H或K(αCD3ε)+H都有轻微的降低，但抑制作用不如抗il-6r scFv分子高，与K+H相似。对于EGF/EGFR信号传导，测量了pAKT，所有抗体都表现出剂量依赖性。

与EGF对照相比，均与亲本K+H抗体非常相似(图3D)。此外，为了研究抗体是否能同时抑制这两种途径，我们用单克隆抗体预孵育细胞，然后用EGF和IL-6联合刺激细胞。HTRF分析显示，pSTAT3和pAKT抑制均存在剂量依赖性抑制(图3E,F)。因此，尽管通过亲和力测定或细胞水平亲和力测量，TriTECMs的EGFR/PD-L1结合存在微小差异，但与亲本K+H格式的二合一抗体相比，它们的功能得到了保留。 

总之为了克服当前临床方法的局限性，作者提出了一种首创的三特异性T细胞参与器和TME和细胞因子调节剂(TriTECM)，通过设计一种具有抗CD3和抗IL- 6R结合部分的二合一双TAA靶向抗体。这种四功能抗体通过同时靶向EGFR和检查点抑制剂程序性死亡配体1(PD-L1)而具有高肿瘤选择性，并且减弱CD3ε结合，减少细胞因子释放和毒性作用。最重要的是，一个抗IL–6R结合片段可以调节T细胞和巨噬细胞激活后释放的IL-6信号，不仅可能支持肿瘤根除，还可以减轻CRS事件。从长远来看，这一概念可能允许使用先前开发的高效抗CD3抗体，从而避免了发现新的功能减弱的CD3结合物的需要。据我们所知，这是第一次将抗IL–6R片段直接融合到三特异性T细胞接合器上，以抑制顺式和反式IL-6介导的信号传导，旨在直接调节但不完全消除T细胞活化后的细胞因子释放。

但是最终，还需要高度复杂的模型来阐明TriTECMs在体内调节CRS的功效。此外，可以通过使用诱导效应功能的Fc来设想五功能分子，并比较两种变体对细胞因子释放和T细胞介导的细胞毒性的影响。

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