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ALPHALISA HTNF-A BF KIT,LQC

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用磷酸酶抑制剂过钒酸盐处理后，FAK 在酪氨酸 397 位的磷酸化水平显著升高，而 FAK 蛋白的总量未受过钒酸盐处理的影响。

用于监测 FAK 抑制剂药理学特性的 HTRF 磷酸化和总 FAK 检测

将 NIH/3T3 小鼠成纤维细胞或人类 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用不同浓度的 FAK 抑制剂处理细胞 30 分钟。移除培养基后，用 50µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16µL 裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。


在人类 HeLa 细胞系和小鼠 NIH/3T3 细胞系中，用 PF-562271 处理后，FAK 在酪氨酸 397 位的磷酸化水平呈剂量依赖性降低，而 FAK 蛋白的总量未受过钒酸盐处理的影响。


用于监测生长因子受体激活的 HTRF FAK 检测读数

将 HUVEC 人类内皮细胞接种到 24 孔胶原 I 包被板中（400,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，将细胞置于无血清条件下孵育。第三天，在无血清条件下用不同浓度的 VEGF 处理细胞 5 分钟。移除培养基后，用 250µL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16µL 裂解物分两次转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4µL 预混合的 HTRF 磷酸化 FAK（Tyr397）或总 FAK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。


经 VEGF 刺激的 HUVEC 细胞中，FAK 在酪氨酸 397 位的磷酸化水平呈剂量依赖性升高。VEGF 可调节 FAK 的磷酸化，并在血管生成和细胞生长中发挥作用。

HTRF 磷酸化 FAK 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将小鼠 NIH/3T3 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天，直至达到 90% 的汇合度。然后用 3mL 补充的 3 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。


用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到小体积白色微量检测板中，然后添加 4µL HTRF® 磷酸化 FAK 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。


使用 HTRF® 总 FAK 试剂盒时，仅需 2,500 个细胞 / 孔即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法时，至少需要 5,000 个细胞才能检测到最小的 ECL 信号。因此，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。


简化通路

FAK 简化通路

这种多结构域蛋白在被细胞表面受体激活后会发生构象变化，主要激活它的受体包括整合素、细胞因子受体（IL1βR、TNFαR）、生长因子受体（EGFR、VEGFR、PDGFR）和 G 蛋白偶联受体（LPA、蛙皮素）。细胞质中的非活性 FAK 单体被激活的受体招募到质膜，随后发生短暂的二聚化，并通过酪氨酸 397 位的自磷酸化而激活。该位点是 Src 家族激酶的停靠位点，可使其他残基发生磷酸化。完全激活的 FAK 会显示出与 FAK 底物（包括 Grb2、PI3K 和钙粘蛋白）的结合位点。FAK 作为细胞外基质 / 整合素信号通路的核心调节因子，在黏着斑的组装 / 解聚调节中是必需的，并在细胞黏附、迁移、存活和机械感知中发挥作用。在钙粘蛋白信号通路中，对内皮细胞 / 上皮细胞之间黏着连接的调节使 FAK 能在细胞连接、血管通透性和血管生成中发挥作用。FAK 可激活多种底物并调控多个信号通路，如 Rho GTPases / 肌动蛋白（细胞骨架重组 / 细胞迁移）、钙粘蛋白 /β- 连环蛋白（细胞连接稳定性 / 血管通透性）、PI3K/AKT（细胞存活）、MAPKs ERK 和 JNK（细胞增殖）以及 p53/MDM2（抗凋亡）。


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