TBSU-PINR-A50K

总 BRD7 检测的药理学验证 ——HELA 细胞上的 GAPDH

将 MCF7 和 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的 PROTAC 化合物 dBRD9 和 VZ185 处理细胞，同时使用 PROTAC ARV-471（PROTAC 雌激素受体）作为无关阴性对照。过夜孵育后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF BRD7 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在这两种细胞中，只有 VZ185 降解剂可引发 BRD7 蛋白的剂量依赖性减少，而在 BRD9 选择性 PROTAC（dBRD9）和 ARV-471 对照条件下，BRD7 的表达水平未受影响。注意，与经 ARV-471 处理的 MCF7 细胞不同，HeLa 细胞中的 GAPDH 保持稳定。

这些结果表明 VZ185 PROTAC 可诱导 BRD7 降解，其 DC50 在纳摩尔范围内，正如 Zoppi 等人（《药物化学杂志》，2019 年）所报道的那样。

DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白发生降解时的浓度。

BRD9 与 BRD7 的谱分析 —— 总 BRD9 检测

BRD9 与 BRD7 的谱分析 —— 总 BRD7 检测

由于 BRD9 是一种癌基因，而 BRD7 具有肿瘤抑制作用，因此选择性降解 BRD9 而非 BRD7 至关重要。

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的 dBRD9 和 VZ185 PROTAC 化合物处理细胞。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并使用总 BRD9 或总 BRD7 检测试剂加入 4µL HTRF 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，VZ185 可诱导 BRD9 和 BRD7 的剂量依赖性减少，而 dBRD9 仅诱导 BRD9 的剂量依赖性减少。在相同条件下，GAPDH 保持稳定（数据未显示）。这一结果证实了 dBRD9 可介导 BRD9 的选择性降解，正如 Remillard 等人（《德国应用化学国际版》，2017 年）和 Zoppi 等人（《药物化学杂志》，2019 年）所描述的那样。

使用 HTRF 总 BRD7 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和五种不同的 HAP1 敲除细胞系（分别敲除 BRD9、BRD7（IV 类）、BRD2、BRD3 或 BRD4（BET 家族））中 BRD7 的表达水平。此前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将 6 种不同的细胞系在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，然后将 16µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，再加入 4µL 预混合的检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD7 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD7 基因完全沉默；而正如预期，在其他细胞系中可很好地检测到 BRD7 水平。这一结果证明了 HTRF BRD7 试剂盒对 BRD9 的选择性，尽管这两种蛋白质有超过 50% 的序列同源性。

注意，与野生型细胞系相比，HAP1 BRDs 敲除细胞系中 BRD7 的表达水平显著更高，这可能表明存在代偿机制。

目录细胞系参考（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；HAP1 BRD9 敲除 #HZGHC000934c003；HAP1 BRD7 敲除 #HZGHC000923c010；HAP1 BRD2 敲除 #HZGHC000356c015；HAP1 BRD3 敲除 #HZGHC000244c004；HAP1 BRD4 敲除 #HZGHC000937c007。

使用敲除 HAP1 细胞系验证总 BRD7 检测的特异性

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD7 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在此条件下，HTRF 总 BRD7 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

HTRF 总 BRD7 检测与蛋白质印迹法的比较

BRD7 信号通路
含溴结构域蛋白 7（BRD7）是 IV 类溴结构域含蛋白质家族的成员。已有报道称，BRD7 在某些癌症（如上皮性卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌和结直肠癌）中表达下调。

BRD7 与 p110/p85 的相互作用竞争，并促进 p85 的核转位，通过其调节 X 盒结合蛋白 1（XBP1）核转位的能力，实现未折叠蛋白反应（UPR）信号传导。

依赖 BRD7 的细胞质中 p85 耗竭会阻碍 PI3 激酶复合体的形成，导致 PI3K 活性降低。因此，BRD7 间接下调了一个参与多种癌症相关过程（包括细胞凋亡、蛋白质合成、增殖和血管生成）的关键通路。

pathway-BRD7-total.svg（BRD7 通路图）

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TERBIUM.SF ULTRA INS-REC PY1150/51, 50K

PROTAC 对 BRD9 和 BRD7 的谱分析

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 BRD7 检测的特异性

HTRF 总 BRD7 检测与蛋白质印迹法的比较

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