产品概述

该 HTRF 细胞水平检测试剂盒可便捷、精准地检测 Tyr15 位点磷酸化的 CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶 1）。CDK1 是 CDK 亚家族成员，与 CDK2、CDK4、CDK6 共同调控哺乳动物细胞的细胞周期进程，作为 M 期促进因子（MPF）的催化亚基诱导细胞进入有丝分裂。CDK1 通过与多种间期周期蛋白（周期蛋白 A、B）结合，促进 G2-M 期转换，并调控 G1 期进程及 G1-S 期转换。Wee1 和 Myt1 蛋白激酶可催化 CDK1 的 Thr14 和 Tyr15 位点磷酸化，从而抑制其活性；而 cdc25 磷酸酶可去除这两个位点的磷酸基团，激活 CDK1。CDK1 Tyr15 位点的抑制性磷酸化对维持基因组完整性、防止 S 期 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/Cdc25A 轴是癌症治疗的潜在靶点，可能为致敏 CDK1 高活性癌细胞提供独特策略。

工作原理

检测原理

磷酸化 CDK1（Tyr15）检测用于定量 Tyr15 位点磷酸化的 CDK1，与 Western Blot 不同，该检测为全板基操作，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白的磷酸化基序，第二种抗体可识别蛋白（与磷酸化状态无关）。蛋白磷酸化后，两种标记抗体形成免疫复合物，使供体与受体荧光团近距离接触，产生 FRET 信号。信号强度与样本中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，可通过无洗涤检测格式评估蛋白的磷酸化状态。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “磷酸化 CDK1（Tyr15）检测原理”）

双板检测流程

双板方案流程：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 CDK1（Tyr15）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力与汇合度。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “磷酸化 CDK1（Tyr15）双板检测流程”）

单板检测流程

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CDK1（Tyr15）可在单个培养板中完成细胞培养、刺激与裂解，无需洗涤步骤。该高通量筛选（HTS）专用方案支持微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “磷酸化 CDK1（Tyr15）单板检测流程”）

检测验证

羟基脲（Hydroxyurea）对磷酸化 CDK1（Tyr15）的调控作用

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，培养 6 小时后，用不同浓度的羟基脲（单链断裂诱导剂）过夜处理。细胞裂解后，取 16 µL 裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）或总 CDK1 检测抗体，过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示，羟基脲以剂量依赖性方式诱导 CDK1 Tyr15 位点磷酸化水平升高，而蛋白表达水平未受处理影响，与预期一致。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “羟基脲调控检测结果”）

Wee1/Myt1 抑制剂对磷酸化 CDK1（Tyr15）的调控作用

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，培养 24 小时后，用 Wee1 激酶抑制剂 Adavosertib 和 PD0166285 处理 2 小时。细胞裂解后，取 16 µL 裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）或总 CDK1 检测抗体，过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示，两种 Wee1 激酶抑制剂均以剂量依赖性方式降低 CDK1 Tyr15 位点磷酸化水平，而蛋白表达水平未受处理影响，与预期一致。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “Wee1/Myt1 抑制剂调控检测结果”）

siRNA 敲低实验验证检测特异性

将 HeLa 细胞以 5,000 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，培养 24 小时后，转染 CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6 特异性 siRNA 及阴性对照 siRNA。孵育 48 小时后裂解细胞，取 16 µL 裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）检测抗体，过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示，与阴性对照 siRNA 转染细胞相比，CDK1 siRNA 转染细胞的信号降低 68%；而 CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6 敲低未引起信号降低，表明该检测对 CDK1 磷酸化具有特异性，与其他细胞周期 CDK 家族成员无交叉反应。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “siRNA 敲低特异性验证结果”）

多种细胞系中磷酸化 CDK1（Tyr15）水平检测

将贴壁细胞（人源 HeLa、MCF7，鼠源 Neuro 2A）和悬浮细胞（如 THP1）以 50,000 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，孵育 24 小时后用补充型裂解缓冲液裂解，取 16 µL 裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）检测试剂，过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示，该检测可在表达不同水平目标蛋白的多种细胞模型中有效检测磷酸化 CDK1（Tyr15）。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “多细胞系检测结果”）

与 Western Blot 的对比验证

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时，用 3 mL 补充型 #1 裂解缓冲液（1X）室温温和振荡裂解 30 分钟。将细胞裂解液用补充型裂解缓冲液系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）检测试剂，同时取等量裂解液进行 Western Blot 平行对比。结果显示，HTRF 检测仅需 1250 个细胞 / 孔即可检测到显著信号，而 Western Blot 需 10,000 个细胞才能获得最低化学发光信号，因此该 HTRF 检测的灵敏度是 Western Blot 的 8 倍。（标注：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit 为图表标识，对应 “与 Western Blot 对比结果”）

简化通路

磷酸化 CDK1 在细胞分裂周期中的作用

CDK1 是 CDK 亚家族成员，与 CDK2、CDK4、CDK6 共同调控哺乳动物细胞的细胞周期进程。有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导周期蛋白 D 合成，触发细胞进入 G1 期，形成活性 CDK4/6 - 周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤蛋白（RB）单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因（如周期蛋白 E）可被转录。G1 期晚期和 S 期早期，周期蛋白 E 与 CDK2 结合并激活 CDK2，进而磷酸化 RB 的其他位点，使其完全失活。随后，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导（如周期蛋白 A），周期蛋白 A 与 CDK2 结合形成周期蛋白 A/CDK2 复合物。激活的 CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，进而激活 CDK1，为细胞分裂周期中 G2 期和 M 期的进程（中心体成熟与分离、染色质浓缩、核膜破裂后进入有丝分裂）提供支持。（标注：phospho-pathway-Phospho-CDK1-y15.svg 为图表标识，对应 “磷酸化 CDK1 简化通路”）

产品规格

• 应用领域：细胞信号传导（Cell Signaling）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
• 裂解缓冲液兼容性：#1 裂解缓冲液、#2 裂解缓冲液、#3 裂解缓冲液、#4 裂解缓冲液
• 分子修饰类型：磷酸化（Phosphorylation）
• 产品类别：试剂盒（Kit）
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
• 靶标物种：人（Human）、鼠（Mouse）
• 技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• 单位规格：500 次检测（500 assay points）