链霉亲和素标记铽穴状化合物,作为 HTRF 免疫分析中的供体荧光团使用。生物素与链霉亲和素的亲和力常数达 10¹⁵M⁻¹,结合快速且稳定,是酶分析、蛋白 - 蛋白结合分析、分子生物学分析等多种检测的理想试剂。该试剂兼容自制缓冲液或现成目录缓冲液。
在 HTRF 相互作用检测中,一个结合伴侣标记供体,另一个标记受体,信号强度与两个伴侣的结合程度成正比。示例流程:链霉亲和素 - 铽穴状化合物与生物素化标记的结合伴侣 A 结合,结合伴侣 B 与标记 HTRF 受体的特异性抗体结合。结合伴侣 B 也可进行生物素化、标签标记、Fc 融合修饰,此时需使用相应的 HTRF 试剂标记受体进行检测。(标注:Assay principle htrf streptavidin-tb cryptate,对应 “链霉亲和素 - 铽穴状化合物检测原理示意图”)
以 20 微升最终反应体积检测生物素化标记的结合伴侣 A 与非标记结合伴侣 B 的相互作用为例:加入两种结合伴侣(10 微升),孵育后加入链霉亲和素 - 铽穴状化合物(5 微升)和标记受体的抗结合伴侣 B 抗体(5 微升),孵育后读取信号。结合伴侣 B 也可进行标签标记、Fc 融合修饰或直接标记,此时需使用相应的 HTRF 试剂标记供体进行检测。(标注:Assay protocol htrf streptavidin-tb cryptate,对应 “链霉亲和素 - 铽穴状化合物检测流程示意图”)
每孔平均偶联物量反映总生物材料含量,优先使用活性部分含量而非总偶联物量。铽穴状化合物和 d2 偶联物的总偶联物量等于活性部分含量;XL665 标记物的总偶联物量因摩尔比不同而异,但活性部分含量恒定,基于订购的检测次数确定。
铽穴状化合物偶联物浓度需避免过高导致读数仪饱和及背景过高,多数情况下 1-5 纳摩尔浓度适宜,在兼容 HTRF 的读数仪上 620 纳米处可产生 20,000-80,000 计数 / 秒。XL665 偶联物浓度需尽可能与检测对应物匹配,确保最大数量的生物分子被 XL665 受体标记。检测 20 纳摩尔浓度的标记分子时,抗标签 - XL665 浓度应相当或更高。