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ALPHA.SF ULTRA FOXM1 TOTAL, 10K

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利用 HAP1 ATG16 敲除细胞验证 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测的特异性

使用 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）试剂盒评估野生型（WT）和 ATG16 敲除（KO）HAP1 细胞中人磷酸化 ATG16L1（Ser278）的表达水平。将细胞系在培养瓶中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时。然后用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟。移除培养基后，加入补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂。同时，使用 GAPDH 管家基因细胞检测试剂盒（# 64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平：将 4 µL 细胞裂解物用 180 µL 11 号稀释剂预稀释，然后将 16 µL 稀释后的样品与 4 µL HTRF GAPDH 管家基因细胞检测试剂混合。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。在两种测试条件下，测得的 GAPDH 水平相当。相比之下，HAP1 野生型细胞中 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）信号显著为阳性，而 HAP1 ATG16 敲除细胞中该信号大幅降低（与阴性信号相当），这证明了 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测对 ATG16L1 蛋白检测的特异性。HAP1 ATG16 敲除（10bp 缺失）细胞系来自 Horizon Discovery # HZGHC000296c010，HAP1 野生型细胞系来自 Horizon Discovery # C631。

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测在多物种细胞系中的通用性

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HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂盒与蛋白质印迹法的比较

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简化通路

巨自噬中简化的 ATG16 信号通路

自噬是一种进化上保守的细胞过程，几乎存在于所有真核细胞中，从酵母到哺乳动物均有发现。自噬对维持体内平衡至关重要，参与多种生理过程，包括应激反应（如饥饿、缺氧、高温）、细胞生长和衰老。相反，自噬机制的功能障碍与癌症、神经退行性疾病、传染病以及心脏和代谢疾病等相关。自噬分为 3 种类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬（以下简称自噬）始于从富含磷脂酰肌醇 3 - 磷酸的膜（如内质网、高尔基体或质膜）上形成芽体，即自噬前体结构（PAS）。这种杯状结构需要由 Atg13、Atg101、FIP200 和 ULK1 蛋白形成的 ULK1/Atg1 复合物。包含在囊泡中的跨膜蛋白 Atg9 参与将 Atg2-Atg18 募集至自噬前体结构。Atg2 蛋白凭借其磷脂转移活性，提供膜延伸所需的磷脂。ULK1 磷酸化并激活 Beclin1，Beclin1 与 Vsp15、Vsp34、Atg14 和 NRFB2/Atg38 结合形成 III 类磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3KC3 - 复合物 1）。该复合物会产生磷酸肌醇三磷酸（PIP3），进一步引导 PI3P 结合蛋白 Atg18/WIPI 1-4 和 Atg12-Atg5-Atg16 复合物的募集。后者与 Atg4 和 Atg7 一起参与吞噬泡上的 LC3B 脂化（从 LC3-I 向 LC3-II 转化），并有助于自噬体成熟，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其中包裹的细胞成分被降解，其组成成分得以循环利用。

丝氨酸 278 位点磷酸化的 ATG16L1 仅存在于新形成的自噬体上，因此对其进行定量可作为自噬囊泡形成和自噬诱导的理想替代指标。重要的是，其水平不受长期应激或自噬晚期阻滞的影响，而这些因素可能会干扰自噬分析。此外，自噬激酶 ULK1 介导的 ATG16L1 磷酸化是自噬诱导的保守指标，可被多种刺激激活。综上所述，分析 ATG16L1 的磷酸化状态是研究自噬诱导的优良读数。