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AlphaLISA (h/m) a-SMA Kit, 500 pts

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品牌： Revvity

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上海普纳生物技术有限公司
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assay-validation-inhibitor-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 抑制剂检测验证）

利用基因沉默（SiRNA）验证均相时间分辨荧光总 PLK1 检测的特异性与选择性

将 HeLa 细胞以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。


在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，用 25 纳摩尔的 ON-TARGETplus 小干扰 RNA（SiRNA，购自 Horizon Discovery）处理细胞，该小干扰 RNA 可特异性靶向 PLK1、PLK2、PLK3 和 PLK4；同时设置非靶向小干扰 RNA 处理组作为对照。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，更换为完全培养基，随后在 37°C 条件下继续孵育 24 小时。


孵育结束后，用 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度）裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升预混合的均相时间分辨荧光总 PLK1 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。


结果显示：用 PLK1 小干扰 RNA 处理的细胞，其总 PLK1 信号显著下调，与非靶向小干扰 RNA 转染组相比，信号降低 98%。


另一方面，用 PLK2、PLK3 和 PLK4 小干扰 RNA 处理的细胞，其信号未出现下降，这证明了该试剂盒具有特异性。


assay-validation-specificity-selectivity-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 检测特异性与选择性验证）

多种人源和鼠源细胞系的检测验证

将贴壁生长的人源细胞（HeLa、MCF7、Hep-G2）和鼠源细胞（NIH 3T3）以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 300 纳摩尔诺考达唑处理细胞，在 37°C 条件下孵育 16 小时。随后用补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升均相时间分辨荧光总 PLK1 检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。


结果显示：均相时间分辨荧光总 PLK1 检测可在表达不同水平 PLK1 蛋白的多种人源细胞模型中有效检测 PLK1 的表达，但在鼠源细胞模型中无法检测。


assay-validation-versatility-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 多细胞系检测验证）

均相时间分辨荧光总 PLK1 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。用 200 纳摩尔诺考达唑处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。接着加入 3 毫升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。


用补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升均相时间分辨荧光总 PLK1 检测试剂。


取等量裂解液，通过蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法进行平行对比检测。


结果显示：在此实验条件下，均相时间分辨荧光总 PLK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。


assay-validation-wb-comparison-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 检测与蛋白质印迹法比较验证）


简化通路

PLK1 信号通路

PLK1（Polo 样激酶 1）在有丝分裂进程中发挥关键作用，近期研究表明，它还在 G2/M 检查点调控、DNA 损伤与复制应激反应及细胞死亡通路中具有重要作用。其信号传导机制较为复杂，涉及多个正反馈环路（如 Bora/AuroraA 通路）和负反馈环路（如 CHK1/ATR 或 CHK2/ATM 通路）。


PLK1 在细胞周期调控中的激活机制：PLK1 可被 AurA 激酶磷酸化 Thr210 位点而激活，激活后的 PLK1 会进一步磷酸化 CDC25。


在自噬 / 凋亡过程中，PLK1 通过多种信号通路（包括 mTOR、c-myc 和 p53 通路）参与多种细胞死亡过程。


近期文献报道了 PLK1 的新功能 —— 参与炎症和免疫反应调控，包括 NF-κB 和 RIG-I/MAV 信号通路。


上述所有生物学过程在肿瘤中均会发生异常改变，且研究发现 PLK1 在多种肿瘤类型中常呈高表达状态，而这种高表达与患者预后不良相关。因此，靶向 PLK1 已成为一种极具潜力的抗癌治疗策略。


pathway-total-plk1-64plktpeg（图示：总 PLK1 信号通路）


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