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ALPHALISA HAPOE KIT,5000PTS

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    当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > HTRF P70S6K P-T389 KIT - 500 PTS 磷酸化p70S6K检测试剂盒 - 500测试

    • HTRF P70S6K P-T389 KIT - 500 PTS 磷酸化p70S6K检测试剂盒 - 500测试
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    HTRF P70S6K P-T389 KIT - 500 PTS 磷酸化p70S6K检测试剂盒 - 500测试

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    品牌： Revvity

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    概述


    这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒可便捷且准确地定量苏氨酸 389 位点（Thr389）磷酸化的 p70S6K 蛋白。该试剂盒兼容大多数细胞类型，是筛选和研究对细胞增殖、存活、侵袭、迁移及胰岛素受体信号传导具有生物学影响的化合物的理想工具，适用于肿瘤学、代谢领域（糖尿病、肥胖症、衰老）、心血管疾病及神经退行性疾病等相关研究。


    工作原理

    p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测原理

    p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测针对 Thr389 位点磷酸化的 p70S6K 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。该检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为 “免洗涤” 检测模式下评估蛋白质磷酸化状态提供了有效手段。
    phospho-p70s6k-thr389-assay-principle（图示：p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测原理）

    p70S6K（Thr389 位点磷酸化）双板检测方案

    双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，最后加入 p70S6K（Thr389 位点磷酸化）均相时间分辨荧光检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。
    phospho-p70s6k-thr389-2-plate-assay-protocol（图示：p70S6K（Thr389 位点磷酸化）双板检测方案）

    p70S6K（Thr389 位点磷酸化）单板检测方案

    使用均相时间分辨荧光试剂检测 Thr389 位点磷酸化的 p70S6K 蛋白，可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。此方案专为高通量筛选（HTS）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。
    phospho-p70s6k-thr389-1-plate-assay-protocol（图示：p70S6K（Thr389 位点磷酸化）单板检测方案）


    检测验证

    基于 p70S6K 磷酸化细胞检测试剂盒的均相时间分辨荧光与蛋白质印迹法对比

    将人 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 1 天。第二天，移除细胞培养液后，加入 3 毫升添加了补充剂的裂解缓冲液，孵育 30 分钟；离心 10 分钟后收集可溶性上清液。取等量裂解液，对蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光检测法进行平行对比。结果显示，使用 p70S6K（Thr389 位点磷酸化）均相时间分辨荧光检测时，3000 个细胞即可被检出，而蛋白质印迹法需 6000 个细胞才能检出。因此，p70S6K 磷酸化均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。
    assay-validation-p70s6k-phospho-t389-1（图示：p70S6K 磷酸化检测中均相时间分辨荧光与蛋白质印迹法对比验证）

    药理学反应：激动剂与拮抗剂作用模式

    将人 HEK293 细胞（每孔 100000 个细胞）与两种浓度的指定抑制剂（渥曼青霉素（Wortmanin）和 LY294002）共同孵育，随后用 1.0 微摩尔的胰岛素在 37°C 条件下刺激 30 分钟。细胞裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案对磷酸化 p70S6K 蛋白进行定量。