ALSU-PCMYC-A-L

assay-validation-activator-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）激活剂检测验证）

将表达 PLK1 的 hela 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。随后用 200 纳摩尔诺考达唑（Nocodazole）与不同浓度的 PLK1 激活剂阿霉素（Doxorubicin）、两种 AuroraA 抑制剂（MLN8054 和 Alisertib）及蛋白降解剂（PROTAC）化合物 CC885 共同处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。之后移除培养基，加入 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）和总 PLK1 均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光（HTRF）信号。

结果符合预期：所有测试化合物均能诱导 PLK1 磷酸化水平下降，但半数有效浓度（EC50）不同 —— 阿霉素为 54 纳摩尔，MLN8054 约为 6 微摩尔，Alisertib 为 28 纳摩尔，蛋白降解剂 CC885 为 68 纳摩尔。

有趣的是，除 MLN8054 外，其他所有化合物均以相似方式降低 PLK1 的表达水平。

assay-validation-inhibitor-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）抑制剂检测验证）

将贴壁生长的人源细胞（ hela、MCF7、Hep-G2）和鼠源细胞（NIH 3T3）以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 300 纳摩尔诺考达唑（Nocodazole）处理细胞，在 37°C 条件下孵育 16 小时。随后用补充后的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光（HTRF）信号。

结果显示，均相时间分辨荧光（HTRF）磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）检测可在表达不同水平该蛋白的多种细胞模型中有效检测磷酸化 PLK1。

assay-validation-versatility-phospho-t210-plk1-64plkt2peg（图示：磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）多细胞系检测验证）

将 hela 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。随后用 300 纳摩尔诺考达唑（Nocodazole）处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。接着加入 3 毫升补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，再加入 4 微升磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。

取等量裂解液，通过蛋白质印迹法（Western Blot）与均相时间分辨荧光（HTRF）法进行平行对比检测。

结果显示，在此实验条件下，均相时间分辨荧光（HTRF）磷酸化 PLK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > ALPHA.SF ULTRA MYC PS62, LYSATE

ALPHA.SF ULTRA MYC PS62, LYSATE

利用磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）和总 PLK1 检测 hela 细胞中抑制剂的特性

多种人源和鼠源细胞系的检测验证

磷酸化 PLK1（苏氨酸 210 位点）均相时间分辨荧光（HTRF）检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较