概述

泛素化在调控蛋白质降解过程中发挥关键作用，该过程通过泛素在三种酶（E1、E2、E3）的依次催化作用下与靶蛋白结合实现，经多聚泛素化修饰的蛋白质随后会被蛋白酶体降解。

泛素通路与多种疾病相关，包括癌症、肌肉萎缩、炎症、病毒感染，以及代谢性疾病和神经退行性疾病。铕穴状化合物标记的泛素试剂可支持灵活的检测方法开发，实现对泛素通路中各个步骤的检测分析。

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• 均相加样即读检测体系

• 无需洗涤步骤

• 背景信号低

• 可从 96 孔 / 384 孔微孔板便捷适配至 384 孔低体积板、1536 孔板等高密板检测体系

• 检测信号稳定，为读数时间选择和检测体系规模设计提供灵活度

检测原理

均相时间分辨荧光泛素检测试剂盒采用铕穴状化合物标记的泛素作为检测试剂，加入 XL665 标记偶联物后，检测信号强度与蛋白泛素化水平呈正相关，且信号稳定性可保持 24 小时以上。本文以 p53 蛋白多聚泛素化检测为例进行说明。

检测操作流程

均相时间分辨荧光泛素检测包含两个基本阶段：酶促反应阶段和均相时间分辨荧光检测阶段。

• 酶促反应阶段：将靶蛋白与泛素化相关酶（E2、E3）、铕离子标记的泛素共同孵育，加入 E1 酶启动酶促反应。

• 检测阶段：加入含乙二胺四乙酸的 XL665 标记试剂，终止酶促反应的同时，实现对泛素化靶蛋白的检测。

检测验证

p53 蛋白多聚泛素化检测

下图表总结了 p53 蛋白多聚泛素化检测的实验结果。

本实验中，铕离子标记的泛素被直接整合至生物素化 p53 靶蛋白的多聚泛素链上，实验操作如下：将 200 纳摩尔 / 升的生物素化 p53 与 300 纳摩尔 / 升的 E2 酶、150 纳摩尔 / 升的 E3 酶、200 纳摩尔 / 升的三磷酸腺苷，以及 20 纳摩尔 / 升泛素 - K 与 500 纳摩尔 / 升泛素的混合液共同孵育；加入 8 纳摩尔 / 升的 E1 酶启动反应；在不同时间点加入乙二胺四乙酸终止泛素化反应；加入链霉亲和素 - XL665 试剂，检测 p53 蛋白的多聚泛素化水平。

* 本泛素化检测实验操作方法参考薮木等人发表于《组合化学与高通量筛选》1999 年 10 月第 2 卷第 5 期 279-287 页的相关研究。

产品规格

其他技术参数

• 应用领域：蛋白 - 蛋白相互作用研究

• 品牌：均相时间分辨荧光检测（HTRF）

• 检测方法：均相时间分辨荧光检测（HTRF）

• 产品类别：荧光试剂

• 运输条件：常温运输

• 检测类型：结合实验

• 核心技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测

• 规格：5000 次检测量