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HTRF ALPHA-SMA KIT - 500 PTS Alpha-SMA检测试剂盒 - 500测试

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品牌： Revvity

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概述

组织损伤后，炎症细胞局部释放的转化生长因子 -β（TGF-β）会激活局部成纤维细胞或静息状态的肝星状细胞（HSCs）。这一过程会促使这些细胞分化为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞的作用是迁移至受损组织，并合成细胞外基质（ECM）成分以修复损伤。肌成纤维细胞的特征是从头表达 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA），该蛋白会整合到肌动蛋白应力纤维中，使细胞具备高度收缩活性。慢性组织损伤会导致肌成纤维细胞（α-SMA 阳性）持续从头形成、过度收缩以及细胞外基质过度沉积，最终引发组织纤维化。

作用机制

检测原理

α-SMA 检测基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）夹心免疫检测格式，包含两种抗体：一种用铕（Eu³⁺）- 穴状化合物标记（供体），另一种用 d2 标记（受体）。这两种抗体会特异性结合 α-SMA，当供体与受体靠近时，会产生荧光 TR-FRET 信号。

检测方案

双板检测方案

为提升灵活性，该检测可采用双板检测方案：先在培养板中接种细胞、进行处理并裂解细胞；检测阶段，将细胞裂解液转移至 96 孔或 384 孔低体积检测微孔板中，随后加入 HTRF（均相时间分辨荧光）试剂。此方案能够监测细胞活力与融合度。检测试剂可预先混合，通过单次加样步骤直接进行检测。该检测既适用于冷冻细胞裂解液，也适用于培养中的新鲜细胞。

检测验证

经 siRNA 实验验证对 α-SMA 亚型的特异性

将人肝星状细胞系 LX-2 * 和小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 10,000 个细胞），并在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。次日，用 α-SMA 小干扰 RNA（siRNA）或阴性对照 siRNA 转染细胞 24 小时，之后用或不用 2.5 ng/mL 的转化生长因子 -β1（TGF-β1）处理细胞，继续培养 24 小时。移除培养基后，用添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞（LX-2 细胞每孔 50 μL，NIH/3T3 细胞每孔 200 μL），在室温（RT）下轻轻振荡 30 分钟。将 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，并加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，在两种细胞系中，与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 α-SMA siRNA 的细胞的 HTRF 特异性信号显著降低（约 60%-70%），这表明 HTRF® α-SMA 检测对 α-SMA 亚型具有特异性，且不会与其他肌动蛋白亚型发生交叉反应。


* 注：LX-2 细胞系由 EMD Millipore 公司提供（产品编号 #SCC064）

肝星状细胞（HSCs）分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将人肝星状细胞系 LX-2 * 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，用浓度递增的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。移除培养基后，用 50 μL 添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，TGF-β1 处理使 α-SMA 表达水平提高了 2 倍，这一现象表明肝星状细胞已分化为肌成纤维细胞。


* 注：LX-2 细胞系由 EMD Millipore 公司提供（产品编号 #SCC064）

肺纤维化中原代人肺成纤维细胞（HLFs）向肌成纤维细胞的分化

将原代人肺成纤维细胞（HLFs）接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。随后，将细胞在无血清培养基中继续孵育 24 小时，之后用浓度递增的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。移除培养基后，用 50 μL 添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟，将 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，用 TGF-β1 长期处理细胞后，α-SMA 表达水平提高了 4 倍，表明原代人肺成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。

成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 6,250 个或 12,500 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。次日，在添加了 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）的无血清、无抗生素培养基中，用浓度递增的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。移除培养基后，用 200 μL 添加了补充剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟，将 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，TGF-β1 长期处理使 α-SMA 表达水平提高了 3 倍，证明成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。

HTRF α-SMA 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 NIH/3T3 细胞接种到 T175 培养瓶中，在 37°C 条件下孵育 2 天。移除培养基后，在室温下轻轻振荡，裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用添加了补充剂的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将各稀释度的 16 μL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 μL HTRF® α-SMA 检测试剂。取等量裂解液，通过蛋白质印迹法进行平行比较。结果显示，使用 HTRF® α-SMA 检测试剂时，仅需 200 个细胞即可检测到最低信号；而蛋白质印迹法需 800 个细胞才能检测到显著信号。因此，HTRF® α-SMA 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路

TGF-β 是一种促纤维化细胞因子，是诱导肌成纤维细胞形成的主要因子。依赖 SMAD 蛋白的 TGF-β 信号通路会激活转录因子 SMAD2/3，进而启动 ACTA2 基因的转录，最终实现 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。这种特异性肌动蛋白亚型会整合到肌动蛋白应力纤维中，使细胞具备分化后肌成纤维细胞特有的强收缩活性。此外，TGF-β 还可通过非依赖 SMAD 蛋白的通路传递信号，具体机制为激活依赖 TAK1 的激酶（p38、JNK、NF-κB）以及 AKT、ERK 激酶。


规格参数

其他规格

项目内容
应用领域（Application）蛋白质定量（Protein Quantification）
品牌（Brand）HTRF
检测方式（Detection Modality）HTRF
产品类别（Product Group）试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）16 μL
运输条件（Shipping Conditions）干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶标类别（Target Class）生物标志物（Biomarkers）
靶标物种（Target Species）人（Human）
技术（Technology）时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域（Therapeutic Area）心血管疾病（Cardiovascular）、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）
单位规格（Unit Size）500 个检测点（500 assay points）


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将 MOLT-4 细胞（永生化人急性 T 淋巴细胞白血病细胞）以 300,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% CO₂条件下用浓度递增的福司柯林（Forskolin）或 H-1152 处理 2 小时后，向每个孔中加入 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻摇晃 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 HDAC4 或磷酸化 HDAC4（Ser246）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


福司柯林是一种细胞渗透性化合物，可直接激活腺苷酸环化酶（产生环磷酸腺苷（cAMP）的酶），导致细胞内 cAMP 水平升高。cAMP 是一种重要的第二信使，参与许多信号转导通路，包括蛋白激酶 A（PKA）的激活。已有研究表明，经福司柯林处理的细胞中磷酸化 HDAC4 蛋白的表达水平会降低。


H-1152 被描述为一种膜渗透性的钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CaMKII）抑制剂，其半数抑制浓度（IC50）约为 180nM。


正如预期，结果显示用福司柯林和 H-1152 处理后，HDAC4 在 Ser246 位点的磷酸化受到明显的剂量依赖性抑制，而 HDAC4 蛋白的表达水平保持稳定。


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human-mouse-total-hdac4-detection-kit

使用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 总 HDAC4 检测的特异性和选择性

在 96 孔板中（40,000 个细胞 / 孔），用 150 µL 培养基将 MOLT-4 细胞与 2µM 的 SMARTPool Accell siRNA（Horizon 公司）共孵育 96 小时，其中 siRNA 分别特异性靶向 HDAC4（货号 #E-003497-00-0020）和 HDAC5（货号 #E-003498-00-0020），并以非靶向 siRNA（货号 #D-001910-10-05）作为对照。通过离心（1400 rpm，8 分钟）移除培养基后，用 50 µL 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 HDAC4 检测抗体。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，用 HDAC4 siRNA 处理的细胞中 HDAC4 显著下调，信号降低 76%。


尽管 IIa 类蛋白之间具有高度同源性，但用 HDAC5 siRNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。


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在多种人和小鼠细胞系上的验证

贴壁人细胞系：HeLa（宫颈）、HEK293（肾）和小鼠细胞系 NIH3T3 以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。


悬浮免疫人细胞系 MOLT-4、Jurkat 和 THP-1（急性白血病）以 30 µL 体积、150,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10 µL 补充的 4X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解 30 分钟。


使用 HTRF 总 HDAC4 试剂盒评估总 HDAC4 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂，在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


在悬浮和贴壁细胞系中均可检测到不同水平的总 HDAC4 蛋白。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度以确保检测在试剂盒的动态范围内进行。


HTRF 总 HDAC4 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的人细胞模型以及小鼠模型（如 NIH3T3 细胞系）中的内源性 HDAC4 蛋白。


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HTRF 总 HDAC4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MOLT-4 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 24 小时后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃裂解细胞 30 分钟。


用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 总 HDAC4 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。


蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 8 倍。


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简化通路

HDAC4 信号通路

HDAC4 根据其磷酸化状态在细胞核和细胞质之间动态穿梭。


响应应激信号时，包括蛋白激酶 C（PKC）、蛋白激酶 D（PKD）和钙 / 钙调蛋白依赖性激酶（CaMK）在内的激酶会直接磷酸化 HDAC4，触发其从细胞核向细胞质输出。磷酸化的 HDAC4 与 14-3-3 蛋白结合并滞留于细胞质中，细胞质形式的 HDAC4 可能具有蛋白去乙酰化酶活性。压迫刺激会增加 PP2A 的活性，导致 HDAC4 去磷酸化，随后 HDAC4 与 14-3-3 蛋白分离并重新定位到细胞核中，从而抑制转录因子。


Runx2 编码肽酶 M10 家族基质金属蛋白酶（MMPs）的一个成员。该家族蛋白参与正常生理过程（如胚胎发育、繁殖和组织重塑）以及疾病过程（如关节炎和转移）中的细胞外基质降解。


MEF2 是一类在肌肉细胞分化和凋亡中起重要作用的转录因子。


此外，HDAC4 通过与 STAT1 相互作用并对其去乙酰化，促进 STAT1 的磷酸化和激活。激活的 STAT1 随后转移到细胞核中诱导基因表达，进而引发炎症和凋亡，并抑制自噬。


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货号：64HDAC4TPEG
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