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当前位置:首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > HTRF BIOTIN-APP SUBSTRATE-EU - 5K PTS

概述


β- 分泌酶(BACE1)是一种可切割淀粉样前体蛋白(APP)的酶,其切割产物为淀粉样 β42 肽,该多肽是阿尔茨海默病(AD)患者脑中不溶性淀粉样斑块的主要形成物质。


本产品采用同时标记生物素与铕离子穴状化合物的 HTRF 淀粉样前体蛋白(APP)底物,搭配链霉亲和素 - XL665(SA-XL665)或链霉亲和素 - d2(SA-d2)使用,依托 HTRF 技术的高稳定性,为筛选 β- 分泌酶(BACE1)抑制剂提供了灵敏、高效的检测方法。


HTRF 检测法相较其他技术具备多项优势:
  • 均相加样即读检测模式

  • 无需洗涤步骤

  • 背景信号低

  • 可从 96 孔 / 384 孔微孔板便捷适配至 384 孔低体积板、1536 孔板等高密板检测体系

  • 检测信号稳定,为读数时间选择、检测体系规模设计提供灵活度


工作原理

检测原理

HTRF β- 分泌酶(BACE1)检测法以同时标记生物素和铕离子穴状化合物的淀粉样前体蛋白(APP)为底物。具有活性的 β- 分泌酶(BACE1)会对该底物进行切割,导致能量转移过程中断,进而使链霉亲和素 - XL665 或链霉亲和素 - d2 的荧光发射信号降低。

1ppi-how-it-works-assay-principle-bace1-assay-64apbkaa-64apbkab.svg

检测操作流程

本检测采用两步法进行:

1. β- 分泌酶(BACE1)酶促反应:将 APP 底物、BACE1 酶和 / 或待测化合物混合后孵育(建议通过时间梯度实验确定最佳孵育时间)。

2. β- 分泌酶(BACE1)活性检测:加入链霉亲和素 - XL665 或链霉亲和素 - d2 完成检测。

2ppi-how-it-works-assay-protocol-bace1-assay-64apbkaa-64apbkab.svg

检测验证

β- 分泌酶(BACE1)多肽类抑制剂的活性评价

本研究利用 HTRF β- 分泌酶(BACE1)检测法,对比了可溶性前体形式 β- 分泌酶(sproBACE1)与经自身加工去除前体结构域的可溶性 β- 分泌酶(sautoBACE1)在不同多肽类抑制剂作用下的酶活性。

在添加及梯度增加多肽类抑制剂浓度的两种条件下,将 25 纳摩尔 / 升的生物素 - APP 底物 - 铕穴状化合物、5 微摩尔 / 升的未标记 APP 肽底物与 6 纳摩尔 / 升的目标酶,在 pH 5.0、30℃条件下共同孵育 3 小时。

3assay-validation-biotin-app-substrate-eu-cryptate-1.svg


本实验测得的半数抑制浓度(IC50)数据详见下表,与文献中通过动力学检测法得到的结果高度一致(参考文献:肯尼迪・M・E 等,《分析生物化学》,2003 年 8 月 1 日;319 (1):49-55)。

实验涉及酶与抑制剂:可溶性前体形式 β- 分泌酶(■)、经自身加工的可溶性 β- 分泌酶(○);抑制剂 KTEEISEVNL - 假脯氨酸 - VAEF(------)、EVNL (GHET) AAEF(——)、ELDL (GHET) AVEF(——)


多肽类抑制剂可溶性前体形式 β- 分泌酶半数抑制浓度(纳摩尔 / 升)经自身加工的可溶性 β- 分泌酶半数抑制浓度(纳摩尔 / 升)
KTEEISEVN - 假脯氨酸 - VAEF92±982±18
EVNL(GHET)AAEF8±36±2
ELDL(GHET)AVEF4±14±1
异戊酰基 - VV - 假脯氨酸 - A - 假脯氨酸未检测出未检测出


产品规格


其他技术参数

  • 应用领域:蛋白定量检测
  • 品牌:HTRF
  • 检测方式:均相时间分辨荧光检测(HTRF)
  • 产品类别:荧光试剂
  • 运输条件:干冰运输
  • 检测靶点类别:生物标志物
  • 检测物种:人类
  • 核心技术:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
  • 检测规格:5000 次检测量


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