品牌: Revvity
信号稳定,检测时间与实验规模灵活可调
HTRF 法人源 RIG-I 结合实验采用竞争性检测模式,实验试剂包括生物素标记的 3' 端磷酸化双链 RNA、链霉亲和素 - d2、带 6× 组氨酸标签的人源 RIG-I 蛋白,以及抗 6× 组氨酸标记的隐穴染料抗体。待测化合物会与生物素标记的 3' 端磷酸化双链 RNA 产生竞争结合,从而抑制荧光共振能量转移(FRET)的发生。
人源 RIG-I 结合实验可在 96 孔或 384 孔低体积白色微孔板中开展(终反应体系 20 微升)。按如下步骤操作:将样品或标准品直接加入检测板,随后加入带组氨酸标签的人源 RIG-I 蛋白,再添加 HTRF 检测试剂,即铽隐穴染料标记的抗 6× 组氨酸抗体,以及结合 d2 标记链霉亲和素的生物素化 3' 端磷酸化双链 RNA。带有 HTRF 荧光基团的试剂可预先混合后一次性加样。全程无需洗涤。该流程可通过按比例调整各试剂加样体积,进一步实现微型化或规模化检测。
在 HTRF 法人源 RIG-I 结合实验中同步检测两种不同的双链 RNA:第一种双链 RNA 的 5' 端带有三磷酸基团,第二种则无。将两种 RNA 分别用稀释液进行梯度稀释,随后加入 RIG-I 蛋白,再向孔板中加入 HTRF 检测试剂完成最终检测步骤。室温孵育 1 小时后采集结果。结果显示,与预期一致,双链 RNA 5' 端三磷酸基团的存在可提升 RIG-I 蛋白的结合亲和力。