登录 • 注册 购物车 15801902527
库存查询 在线订购

当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > HTRF (H/M) CDK8 TOTAL KIT - 10K PTS

  • HTRF (H/M) CDK8 TOTAL KIT - 10K PTS
/

HTRF (H/M) CDK8 TOTAL KIT - 10K PTS

分享给好友
下载产品资料
rvty_ls_manual_64cdk8tpeg-64cdk8tpeh
下载SDS
rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_US rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_UK rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_SPA rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_ITA rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_ELL rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_DEU rvty_ls_sds_64CDK8TPEH_FRA
收藏 咨询

品牌： Revvity

  • 产品详情
  • 相关解决方案
  • 相关资源
  • 相关视频
  • 相关问答

概述


CDK8 及其旁系同源物 CDK19，也被称为 “中介体激酶”，是细胞周期蛋白依赖性激酶，与细胞内稳态和发育程序相关。CDK8 和 CDK19 以互斥的方式整合到一个名为中介体激酶模块的 4 蛋白复合体中。该模块与中介体（一种调控 RNA 聚合酶 II 介导的基因表达的 26 亚基蛋白复合体）可逆结合。CDK8 与多种人类疾病的发生发展相关，尤其是癌症。


工作原理

总 CDK8 检测原理

总 CDK8 检测用于定量细胞裂解物中 CDK8 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK8 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测形式下为评估蛋白的表达水平提供了方法。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

总 CDK8 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入 HTRF 总 CDK8 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

总 CDK8 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK8 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）


检测验证

使用 JH-XI-10-02 PROTAC® 降解总 CDK8

将 HT29 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后在 37°C、5% CO₂条件下，用 3 种浓度的 CDK8 PROTAC（JH-XI_10-02）、CDK8 弹头（皮质抑素衍生物）或 CRBN 结合剂（泊马度胺）处理 24 小时。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。与经 CDK8 弹头和 CRBN 配体处理的细胞（信号无变化）相比，CDK8 PROTAC 诱导 CDK8 蛋白部分降解，信号降低 41%。


ATPlite™检测测得的 ATP 水平恒定，表明这些化合物对细胞增殖或活力无影响。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

HT-29 和 Jurkat 细胞中总 CDK8 的降解

将 HT-29 和 Jurkat 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用递增浓度的 CDK8 PROTAC（JH-XI-10-02）处理细胞 24 小时，之后用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。在检测步骤中，将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，并加入 4 µL 总 CDK8 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


用 CDK8 PROTAC 处理细胞可诱导 Jurkat 和 HT-29 细胞中 CDK8 蛋白的部分降解（分别降解 50% 和 40%）。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

使用 siRNA 验证总 CDK8 的特异性

将 HT-29 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 CDK8 和 CDK19 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。


孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK8 siRNA 的细胞信号降低了 83%。转染 CDK19 siRNA 的细胞未观察到信号降低。这些数据表明，HTRF 总 CDK8 检测对 CDK8 蛋白的检测具有特异性，且不会与 CDK19 发生交叉反应。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

不同细胞系中总 CDK8 的检测

将贴壁的人细胞系 HeLa、HT-29、HCT116 或小鼠 NIH-3T3 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


HTRF 总 CDK8 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 CDK8。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）

HTRF（人 / 小鼠）总 CDK8 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HT-29 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并移除细胞培养基后，用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。


使用补充的 1 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。


使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。


在这些条件下，HTRF 总 CDK8 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 16 倍。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）


简化通路

CDK8 信号通路

传统上，CDK 分为两个亚家族：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）以及转录 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。CDK8 / 细胞周期蛋白 C 与 Med12 和 Med13 一起，构成了中介体复合体中的一个子模块，该子模块被认为起着分子开关的作用，可抑制 RNA 聚合酶 II 的募集和转录起始。


CDK8 子模块可独立于中介体复合体直接与转录因子相互作用，从而调控信号通路。这些作用包括 NOTCH 依赖性信号传导、转化生长因子 -β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）受体信号传导，以及信号转导和转录激活因子（STAT）信号传导。


human-mouse-total-CDK8-detection-kit（人 / 小鼠总 CDK8 检测试剂盒）


规格


其他规格

  • 应用：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
  • 分子修饰：总量
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16 µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷蛋白
  • 靶标物种：人、小鼠
  • 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 单位规格：10,000 个检测点


    没有数据
    没有数据
    没有数据
货号：64CDK8TPEH
一键复制
参考价格 ¥ 178104.09
产品规格
  • ￥178104.09
参考货期：3-4周
选择数量
当前规格1件起购
加入购物车 询价
相关产品推荐
上海普纳生物技术有限公司
-last-sibling-br paragraph-JOTKXA paragraph-element br-paragraph-space" style="-webkit-font-smoothing: antialiased; box-sizing: border-box; -webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0); line-height: 28px; overflow-anchor: auto; font-family: Inter, -apple-system, BlinkMacSystemFont, "Segoe UI", "SF Pro SC", "SF Pro Display", "SF Pro Icons", "PingFang SC", "Hiragino Sans GB", "Microsoft YaHei", "Helvetica Neue", Helvetica, Arial, sans-serif; text-wrap-mode: wrap; background-color: rgb(255, 255, 255); color: rgba(0, 0, 0, 0.85) !important;">将人胚肾 293 细胞（Hek 293）以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。


移除细胞培养基后，用不同浓度的 PROTAC 化合物 ZNL-02-096 处理细胞，同时使用 Wee1 抑制剂 AZD-1775 作为 PROTAC 合成的对照。作为对照，在添加 PROTAC 之前，将细胞与蛋白酶体抑制剂环氧霉素（Epoxomicin）在 37°C 下预孵育 1 小时。


孵育 4 小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1。


细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF Wee1 检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充有 12 µL 稀释剂 #8）也转移到微孔板中，以便使用 α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPET/G/H）监测 α- 微管蛋白水平。 overnight 孵育后，记录两个试剂盒的 HTRF 信号。


ZNL-02-096 PROTAC 引发 Wee1 蛋白呈剂量依赖性减少，DC50* 为 0.41nM，而特异性 Wee1 抑制剂 AZD-1775 则未引起这种减少。在环氧霉素存在的情况下，未观察到 Wee1 减少，这表明降解是由泛素 - 蛋白酶体系统驱动的。在相同实验条件下，测得的 α- 微管蛋白水平保持不变。


*DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证总 Wee1 检测的特异性

将 Hek293 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。然后用针对 Wee1 或 Wee2 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。 overnight 孵育后，记录 HTRF 信号。


与转染阴性 siRNA 的细胞相比，Wee1 siRNA 导致信号降低 80%。在转染 Wee2 siRNA 的细胞中未观察到信号降低。在相同实验条件下，未观察到细胞毒性作用，这通过 ATPlite™ 检测测得的 ATP 水平得到证实。

使用多种细胞系验证总 Wee1 检测的通用性

将贴壁的人类细胞（Hek 293、Hela、HepG2、A431）和小鼠 NIH3T3 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中。孵育 24 小时后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。 overnight 孵育后，记录 HTRF 信号。


HTRF 总 Wee1 检测能够有效检测多种人类和小鼠细胞模型中的 Wee1。

HTRF 总 Wee1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养，在 37°C、5% CO₂ 条件下达到汇合。


移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。


使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和每种稀释液转移到 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。 overnight 孵育后，记录 HTRF 信号。


将等量的裂解物上样到凝胶中，以进行 HTRF 与蛋白质印迹法的并列比较。


在这些条件下，HTRF 总 Wee1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

简化通路

总 Wee1 信号通路

Wee1 是丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族的成员，在细胞周期调控中发挥重要作用。


为确保细胞周期事件的阶段和协同性，CDK 的激活尤为重要。CDK / 细胞周期蛋白复合物调控细胞周期各个阶段的启动和进展，从而控制细胞增殖和凋亡。S 期内以及 G1 到 S 期和 G2 到 M 期的转换时，可诱导细胞周期停滞或延迟。


响应 DNA 损伤时，Wee1 的活性会被上调，以促进细胞周期停滞，阻止细胞进入下一个细胞周期阶段，直至 DNA 复制或修复完成。


在 G2/M 细胞周期检查点，Wee1 在 Tyr15 位点磷酸化并抑制 Cdk1。在 S 期，Wee1 磷酸化 CDK2 的 Tyr15 位点。起抵消作用的磷酸酶 CDC25 会去除这种抑制性磷酸化，从而激活 CDK1 或 CDK2 并促进有丝分裂进入。Wee1 与 CDC25 活性的平衡决定了有丝分裂进入和细胞分裂的时机。


许多癌症存在 G1/S 检查点缺陷，这通常与 p53 突变有关。因此，抑制或降解 Wee1 会导致 G2/M 检查点失效，并能使肿瘤对 DNA 损伤策略敏感。

规格

其他规格


    没有数据
    没有数据
    没有数据
货号：64WEE1TPEG
一键复制
参考价格 ¥ 30615.71
产品规格
  • ￥30615.71
参考货期：3-4周
选择数量
当前规格1件起购
加入购物车 询价
相关产品推荐
上海普纳生物技术有限公司