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HTRF EIF2 ALPHA P-S52 KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

磷酸化 EIF2α 检测试剂盒旨在基于细胞对 EIF2α 上 Ser52 位点的磷酸化进行定量检测。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，肝细胞内的脂质堆积（脂肪变性）会诱发氧化应激和内质网应激，进而导致磷酸化 EIF2α（Ser52）水平升高。磷酸化的 EIF2α 会减少整体蛋白质合成，并激活转录激活因子 4（ATF4），而 ATF4 会调控参与代谢调节、营养摄取、细胞氧化还原状态及细胞凋亡相关特定基因的表达。

工作原理

磷酸化 EIF2α（Ser52）检测原理

磷酸化 EIF2α（Ser52）检测可对 Ser52 位点磷酸化的 EIF2α 进行测量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测采用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接相关，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。


磷酸化 EIF2α（Ser52）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，之后再加入磷酸化 EIF2α（Ser52）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


磷酸化 EIF2α（Ser52）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 EIF2α（Ser52）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。


检测验证

人 HeLa 细胞中 HTRF 与 WB 磷酸化 EIF2α 检测对比

HeLa 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 MEMα 培养基中，于 T175 cm² 培养瓶中培养 2 天。在 37°C 条件下，用 100 nM 花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟，随后用 3 mL 的 1X 补充裂解缓冲液 #4 进行裂解。将细胞裂解物用补充裂解缓冲液 #4 进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行分析。结果显示，HTRF 磷酸化 EIF2α 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。


常山碱对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

用不同浓度的常山碱处理 HepG2 细胞和 NIH-3T3 细胞。裂解后，将裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，常山碱处理能显著提高 EIF2α 的 Ser52 位点磷酸化水平，而其表达量保持稳定。


毒胡萝卜素对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

用毒胡萝卜素（一种通过诱发内质网应激来抑制肌浆网 / 内质网 Ca²⁺/ATP 酶的抑制剂）在 HepG2 细胞上进行剂量反应实验。采用双板方案，用不同浓度的毒胡萝卜素处理细胞后进行裂解，将裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。结果显示，EIF2α 的表达量保持稳定，表明该化合物对细胞无细胞毒性作用。


GSK2606414 对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

培养 HepG2 细胞和 C2C12 细胞，用不同浓度的 GSK2606414（一种选择性 PERK 抑制剂）处理后，再用 500 nM 毒胡萝卜素激活。移除培养基后裂解细胞，取 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。


棕榈酸对总 EIF2α 和磷酸化（Ser52）EIF2α 的药效作用

采用双板检测方案，用与牛血清白蛋白（BSA）结合的棕榈酸溶液在 HepG2 细胞上进行剂量反应实验。在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的棕榈酸 / BSA 处理细胞 6 小时。加入裂解缓冲液后，取 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。记录 HTRF 信号，双向方差分析（2-way ANOVA）结果表明，棕榈酸能显著提高 EIF2α 的 Ser52 位点磷酸化水平。

简化通路

EIF2α 的功能与调控

真核起始因子 2（EIF2）在蛋白质翻译起始过程中发挥重要作用，它能将起始甲硫氨酰 tRNA 转移到核糖体的 40S 亚基上。在多种细胞应激条件下，EIF2α 亚基的磷酸化是一种下调整体蛋白质合成的机制，这使细胞能够节省资源，同时启动新的基因表达程序以避免应激损伤。细胞应激的类型多样，如内质网应激、氨基酸缺乏或氧化应激等。有四种激酶可响应不同类型的应激而磷酸化 EIF2α：HRI（红细胞中血红素缺乏时）、GCN2（氨基酸缺乏和营养匮乏时）、PKR（病毒感染时）以及 PERK（内质网应激时）。

规格参数

其他规格

  • 应用领域：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 分子修饰：磷酸化
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16 µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷酸化蛋白质
  • 靶标物种：人、小鼠
  • 技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
  • 单位规格：50,000 个检测点


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ht); margin-top: var(--md-box-samantha-h4-margin-top); overflow-anchor: auto; font-family: Inter, -apple-system, BlinkMacSystemFont, "Segoe UI", "SF Pro SC", "SF Pro Display", "SF Pro Icons", "PingFang SC", "Hiragino Sans GB", "Microsoft YaHei", "Helvetica Neue", Helvetica, Arial, sans-serif; text-wrap-mode: wrap; background-color: rgb(255, 255, 255); margin-bottom: var(--md-box-samantha-h4-margin-bottom) !important; padding-bottom: 0px !important;">3 种 CREBBP/p300 PROTAC 的剂量效应和时间进程研究
实验在 HeLa 细胞上进行，方法与上一节所述相同，不同之处在于用不同浓度的每种 CREBBP/p300 PROTAC（或弹头 GNE-781）处理细胞 4 小时或 20 小时。如前所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 CREBBP 和总 p300，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。


三种 PROTAC 均诱导 CREBBP 和 p300 的剂量依赖性降解，而弹头 GNE-781 则无此作用。这些化合物对两种蛋白质的作用相近（如效力和动力学）。两种处理时间后，三种降解剂的效力排名相同，其中沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的效力分别是 PROTAC CBP/p300 Degrader-1 的 4 倍和 dCBP-1 的 10 倍（基于 DC50 值）。处理 20 小时后，PROTAC CBP/p300 Degrader-1 和 dCBP-1 的效力显著提高（2.5 至 5 倍），沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的降解效率也从 65% 提高到 80%。值得注意的是，即使处理 20 小时，这些化合物也未诱导明显的细胞毒性作用（ATPlite 1step 检测，数据未显示）。


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总 CREBBP 和总 p300 检测特异性的验证

将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（总 CREBBP 检测为每孔 50,000 个细胞，总 p300 检测为每孔 12,500 个细胞），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，用针对人 CREBBP 或其同源物人 p300 的 ON-TARGETplus SMARTPool siRNA 转染细胞，同时使用非靶向 siRNA 作为阴性对照。用 siRNA 孵育 24 小时后，更换培养基再孵育 24 小时，然后用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解后，如第一部分所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 CREBBP 和总 p300，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。


siRNA 实验表明，HTRF 总 CREBBP 和总 p300 试剂盒均能特异性检测目标蛋白质，而不会识别该家族的另一个成员。用 CREBBP siRNA 处理使总 CREBBP 检测的信号降低 70%，而敲低 p300 并未导致该检测的信号降低。相反，用 p300 siRNA 处理使总 p300 检测的信号降低 86%，而沉默 CREBBP 基因并未导致该检测的信号降低。在 CREBBP 和 p300 siRNA 存在的情况下，ATPlite 发光信号保持稳定，表明 HTRF 信号的降低与细胞毒性作用无关。


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不同人源和鼠源细胞系中总 CREBBP 水平的评估

实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将人源细胞系 SH-SY5Y、MCF7、HeLa、A431 和 A549，以及鼠源细胞系 NIH-3T3 和 Neuro-2a 接种到 96 孔培养板中（每孔 100,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。次日，用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，再加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 试剂盒检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


HTRF 总 CREBBP 试剂盒适用于人源和鼠源细胞模型，能有效检测不同表达水平细胞系中的 CREBBP。


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HTRF 总 CREBBP 检测与蛋白质印迹法（WB）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，在含完全培养基的条件下于 37°C、5% CO₂环境中培养，直至汇合度达到约 90%。用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，并用补充的裂解缓冲液对裂解物进行系列稀释。为检测总 CREBBP，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，并加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 检测试剂。取等量裂解物进行蛋白质印迹法检测，与 HTRF 检测进行平行比较。


使用 HTRF 总 CREBBP 检测时，仅需每孔 500 个细胞即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该条件下，HTRF 总 CREBBP 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


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简化通路

CREBBP/p300 信号通路

转录共激活因子 CREBBP 和 p300 通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和其他转录调节因子（如转录因子 c-Myc、p53 和 FoxO1）进行乙酰化，来调节基因表达。


CREBBP 和 p300 是许多由细胞内或细胞外信号激活的重要信号通路的核心。它们调控生长因子和激素信号传导，如由核激素受体 AR（雄激素受体）和 ER（雌激素受体）介导的信号传导。其他信号示例包括缺氧、细胞应激（涉及 MAP 激酶 p38、JNK 和 ERK）、高血糖、GPCR 激动剂（诱导 cAMP 信号传导）和细胞因子（由 JAK/STAT 通路介导）。CREBBP/p300 还调控 TLR/IRF-3 通路，以控制先天免疫应答。CREBBP 和 p300 均是 BRD4 占据位点（如 H3K27ac）的组蛋白乙酰化所必需的，也是 BRD4 结合到基因启动子和增强子以调控相关基因转录所必需的。


所有这些通路最终都利用细胞核中的 CREBBP 和 p300 作为下游效应器，来控制关键的细胞功能，如细胞周期调控和分化、胚胎发育和稳态。


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