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HTRF FGFR1 TOTAL KIT - 500 PTS 成纤维细胞生长因子受体1检测试剂盒 - 500测试

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概述

总 FGFR1 细胞检测可监测总 FGFR1 的表达水平，并能与磷酸化 FGFR1 试剂盒配合使用，作为归一化检测。FGFR1 的突变与多种癌症相关，包括肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌、卵巢癌等。

工作原理

总 FGFR1 检测原理

HTRF 总 FGFR1 检测可对细胞裂解物中 FGFR1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 FGFR1 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FGFR1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质的表达水平。

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总 FGFR1 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总 FGFR1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 FGFR1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 FGFR1 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

多种人类癌细胞系中 FGFR 蛋白水平的评估

将不同人类癌症细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养。随后用 3 mL 补充裂解缓冲液 #4（1X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。

对每个细胞系 25 µg 总蛋白和 KG-1 细胞系 15 µg 总蛋白的总 FGFR1-2-3-4 蛋白水平进行分析。将 16 µL 归一化样品转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 总 FGFR1、FGFR2、FGFR3 或 FGFR4 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示四种不同 FGFR 受体的表达模式存在差异：FGFR1 在 DMS114 肺癌模型和 KG-1 骨髓性白血病模型中高表达；FGFR2 在 SNU-16 和 Kato-III 胃癌模型中优先表达；FGFR3 在 KMS-11 多发性骨髓瘤细胞系中表达；FGFR4 在 MDA-MD-453 乳腺癌模型或 HuH7 肝癌细胞系中表达。此外，这些结果证明了 HTRF 总 FGFR 试剂盒的识别特异性。

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使用磷酸化（Tyr653/654）和总 FGFR1 试剂盒测量抑制效果

将人 KG-1 细胞（骨髓性白血病）以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到半面积 96 孔培养处理板中，每孔加入 25 µL 完全培养基。用 5 µL 浓度递增的 FGFR 抑制剂 AZD4547 处理细胞，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。处理后，用 10 µL 补充裂解缓冲液 #4（4X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。
将人 DMS-114 细胞（肺癌）接种到 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），过夜孵育。用浓度递增的 AZD4547 处理细胞 24 小时（37°C、5% CO₂）后，用 100 ng/ml FGF2 刺激 10 分钟。处理后，用 25 µL 补充裂解缓冲液 #4（1X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FGFR1（Tyr653/654）或总 FGFR1 检测试剂。室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，结果显示 AZD4547 处理会对 FGFR1 的 Y653/654 磷酸化产生剂量依赖性抑制，而 FGFR1 的表达水平保持恒定。

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HTRF 总 FGFR1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 KG-1 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 72 小时后，用 3 mL 补充裂解缓冲液 #4（1X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 总 FGFR1 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。