BRD9（含 BRD9 溴结构域蛋白 9）是含溴结构域蛋白家族 IV 的成员，该家族还包括 BRD7。BRD9 是 SWI/SNF（GBAF 或 ncBAF）复合体的亚基，可结合组蛋白的乙酰化赖氨酸残基，介导染色质重塑和转录调控。BRD9 参与多能性调节和细胞发育。
BRD9 过表达与神经发育障碍以及急性髓系白血病等癌症相关。最近，通过 PROTAC 分子靶向 BRD9 降解已成为一种新颖且有前
景的治疗方法。然而，BRD9 和 BRD7 蛋白有 72% 的氨基酸残基相似性，因此化合物很可能同时靶向原癌基因 BRD9 和抑癌基因 BRD7。因此，必须仔细研究靶向 BRD9 或 BRD7 的化合物的选择性。为此，HTRF 总 BRD7 检测试剂盒是 HTRF 总 BRD9 检测试剂盒的重要配套检测工具，可实现可靠的化合物分析。
HTRF 总 BRD9 检测可定量细胞裂解物中 BRD9 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD4 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD9 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并为在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达提供了一种方法。
HTRF 总 BRD9 检测原理
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 BRD9 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
HTRF 总 BRD9 双板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 BRD9 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。
HTRF 总 BRD9 单板检测方案
将贴壁人细胞系 MCF7 和 MDA-MB-543 细胞（乳腺）、HELA（宫颈）、SH-SY5Y（骨髓神经母细胞）以及小鼠细胞系 NIH3T3 和 Neuro2A 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。
将悬浮免疫人 PL-21 细胞系（急性髓系白血病）以 100,000 个细胞 / 孔的密度、30µL / 孔的量接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10µL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）裂解。
使用 HTRF 总 BRD9 试剂盒评估 BRD9 的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移到低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。值得注意的是，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。
HTRF 总 BRD9 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD9。
总 BRD9 检测在多种细胞系上的验证
human-total-BRD9-detection-kit-5.svg（人总 BRD9 检测试剂盒 - 5 示意图）
将 MCF7 和 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的一系列 PROTAC 化合物处理细胞：dBRD9 和 VZ185，以及作为阴性无关对照的 PROTAC ARV-471（PROTAC 雌激素受体）。过夜孵育后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF BRD9 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。
在这两种细胞类型中，两种 BRD9 PROTAC 降解剂均能触发 BRD9 蛋白呈剂量依赖性减少，而在 ARV-471 对照条件下，BRD9 的表达水平以及 GAPDH 均保持稳定。这些结果表明 PROTAC 可诱导特异性 BRD9 降解，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，与预期一致（Remillard 等人，《德国应用化学国际版》，2017 年；Zoppi 等人，《药物化学杂志》，2019 年）
DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白发生降解时的浓度。
BRD9 与 BRD7 的靶向分析 —— 总 BRD9 检测
