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HTRF HISTONE H3 P-S10 KIT - 500 PTS 磷酸化组蛋白H3(S10)检测试剂盒-500测试

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品牌： Revvity

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概述


磷酸化组蛋白 H3（Ser10）检测可实现对组蛋白 H3 尾部 Ser10 位点磷酸化的检测，组蛋白 H3 是基因表达和有丝分裂的关键调控因子。Ser10 位点的磷酸化与有丝分裂和减数分裂过程中的染色体凝缩密切相关。


工作原理

磷酸化组蛋白 H3（Ser10）检测原理

磷酸化组蛋白 H3（Ser10）检测用于测定丝氨酸 10（Ser10）位点磷酸化的组蛋白 H3。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化组蛋白 H3（Ser10）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。


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磷酸化组蛋白 H3（Ser10）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化组蛋白 H3（Ser10）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


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磷酸化组蛋白 H3（Ser10）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化组蛋白 H3（Ser10）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。


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检测验证

HTRF 磷酸化组蛋白 H3（Ser10）检测与蛋白质印迹法的比较

将指数生长期的 HeLa 细胞培养至 80% 汇合度，并用诺考达唑处理 16 小时。移除培养基并裂解细胞后，通过离心收集可溶性上清液。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 的平行比较。HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 25 倍。使用 HTRF 磷酸化组蛋白 H3（Ser10）检测时，仅需 256 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法则需要 6,400 个细胞才能产生信号。


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磷酸化组蛋白 H3（Ser10）作为细胞增殖的有丝分裂生物标志物

将 HeLa 和 A431 细胞接种到 96 孔板中，用诺考达唑（一种抗有丝分裂剂，可解聚微管并将细胞阻滞在有丝分裂期，此时组蛋白 H3 Ser10 位点磷酸化水平最高）处理 16 小时。移除细胞培养基后，加入 50 µL、100 µL 或 200 µL 裂解缓冲液，孵育 30 分钟。将 16 µL 各裂解物转移至 384 孔小体积白色板中进行 HTRF 分析。将裂解体积增加至 200 µL 可改善 HTRF 检测信号的线性度。


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磷酸化组蛋白 H3（Ser10）作为 Aurora 激酶 B 抑制的读出指标

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简化通路

细胞周期中的磷酸化组蛋白 H3-Ser10

组蛋白的整体磷酸化水平在细胞周期中波动显著，其特征是有丝分裂期组蛋白 H3 的 Ser10 位点磷酸化出现峰值。Aurora 激酶 B 直接负责有丝分裂期组蛋白 H3 Ser10 位点的磷酸化。Aurora 激酶 A 与 BORA 形成复合物，在 G2 期负责 PLK1 的初始激活，进而在 G2/M 转换检查点激活细胞周期蛋白依赖性激酶 1，推动细胞进入有丝分裂。Aurora 激酶 A 在人类癌症中常发生扩增，且其在人类肿瘤中的过表达与不良预后和基因组不稳定性相关。此外，Aurora 激酶 B 的高表达水平与胶质母细胞瘤、卵巢癌和肝细胞癌的不良预后相关。


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规格


  • 其他规格
  • 应用：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 分子修饰：磷酸化
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16 µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷酸化蛋白
  • 靶标物种：人、小鼠
  • 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 治疗领域：神经科学
  • 单位规格：500 个检测点


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使用 siRNA 验证总 CDK8 的特异性

将 HT-29 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 CDK8 和 CDK19 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。


孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK8 siRNA 的细胞信号降低了 83%。转染 CDK19 siRNA 的细胞未观察到信号降低。这些数据表明，HTRF 总 CDK8 检测对 CDK8 蛋白的检测具有特异性，且不会与 CDK19 发生交叉反应。


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将贴壁的人细胞系 HeLa、HT-29、HCT116 或小鼠 NIH-3T3 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充的裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


HTRF 总 CDK8 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 CDK8。


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HTRF（人 / 小鼠）总 CDK8 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HT-29 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并移除细胞培养基后，用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。


使用补充的 1 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 CDK8 检测试剂。


使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。


在这些条件下，HTRF 总 CDK8 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 16 倍。


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传统上，CDK 分为两个亚家族：协调细胞周期进程的 CDK（CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）以及转录 CDK（CDK7、CDK8、CDK9、CDK12 和 CDK13）。CDK8 / 细胞周期蛋白 C 与 Med12 和 Med13 一起，构成了中介体复合体中的一个子模块，该子模块被认为起着分子开关的作用，可抑制 RNA 聚合酶 II 的募集和转录起始。


CDK8 子模块可独立于中介体复合体直接与转录因子相互作用，从而调控信号通路。这些作用包括 NOTCH 依赖性信号传导、转化生长因子 -β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）受体信号传导，以及信号转导和转录激活因子（STAT）信号传导。


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移除细胞培养基后，用不同浓度的 PROTAC 化合物 ZNL-02-096 处理细胞，同时使用 Wee1 抑制剂 AZD-1775 作为 PROTAC 合成的对照。作为对照，在添加 PROTAC 之前，将细胞与蛋白酶体抑制剂环氧霉素（Epoxomicin）在 37°C 下预孵育 1 小时。


孵育 4 小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1。


细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF Wee1 检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充有 12 µL 稀释剂 #8）也转移到微孔板中，以便使用 α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPET/G/H）监测 α- 微管蛋白水平。 overnight 孵育后，记录两个试剂盒的 HTRF 信号。


ZNL-02-096 PROTAC 引发 Wee1 蛋白呈剂量依赖性减少，DC50* 为 0.41nM，而特异性 Wee1 抑制剂 AZD-1775 则未引起这种减少。在环氧霉素存在的情况下，未观察到 Wee1 减少，这表明降解是由泛素 - 蛋白酶体系统驱动的。在相同实验条件下，测得的 α- 微管蛋白水平保持不变。


*DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证总 Wee1 检测的特异性

将 Hek293 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。然后用针对 Wee1 或 Wee2 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。 overnight 孵育后，记录 HTRF 信号。


与转染阴性 siRNA 的细胞相比，Wee1 siRNA 导致信号降低 80%。在转染 Wee2 siRNA 的细胞中未观察到信号降低。在相同实验条件下，未观察到细胞毒性作用，这通过 ATPlite™ 检测测得的 ATP 水平得到证实。