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HTRF EIF2 ALPHA TOTAL KIT - 10K PTS

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品牌： Revvity

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概述


总 EIF2α 细胞检测可监测总 EIF2α 水平，且可作为磷酸化 EIF2α 检测试剂盒的归一化检测方法。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，肝细胞内脂质蓄积（脂肪变性）会诱发氧化应激和内质网应激，导致磷酸化 EIF2α（Ser52）水平升高。磷酸化的 EIF2α 会减少整体蛋白质合成，并激活转录激活因子 4（ATF4），该因子可调控参与代谢调节、营养摄取、细胞氧化还原状态及细胞凋亡的特定基因表达。


工作原理

总 EIF2α 检测原理

总 EIF2α 检测可对细胞裂解物中 EIF2α 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 EIF2α 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 EIF2α 时，添加这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中目标蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，为评估蛋白质表达提供了便捷手段。


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总 EIF2α 双板检测方案

双板方案流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再添加总 EIF2α HTRF 检测试剂。该方案可对细胞活力和汇合度进行监测。


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总 EIF2α 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 EIF2α 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）设计方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。


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检测验证

基于人 HeLa 细胞的总 EIF2α 检测：HTRF 与 WB 对比

HeLa 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 MEMα 培养基中，于 T175 cm² 培养瓶中培养 2 天。在 37°C 条件下，用 100 nM 花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟，随后用 3 mL 1X 补充裂解缓冲液 #4 裂解细胞。将细胞裂解物用补充裂解缓冲液 #4 进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法平行分析。使用 HTRF 总 EIF2α 试剂盒时，仅需 0.2 µg 总蛋白即可实现最低信号检测，表明 HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。


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常山碱对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药效作用

用不同浓度的常山碱处理 HepG2 和 NIH-3T3 细胞。裂解后，将裂解物转移至低体积白色微孔板中，再添加 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。常山碱处理可显著增加 EIF2α 在 Ser52 位点的磷酸化水平，而其表达量保持稳定。


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毒胡萝卜素对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药效作用

采用毒胡萝卜素（一种通过诱发内质网应激抑制肌浆网 / 内质网 Ca²⁺/ATP 酶的抑制剂）对 HepG2 细胞进行剂量反应实验。按照双板方案，用不同浓度的毒胡萝卜素处理细胞并裂解。将裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，最后添加 HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。结果显示 EIF2α 表达水平保持稳定，表明该化合物对细胞无细胞毒性作用。


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GSK2606414 对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药效作用

培养 HepG2 和 C2C12 细胞，用不同浓度的 GSK2606414（一种选择性 PERK 抑制剂）处理后，再用 500 nM 毒胡萝卜素激活。移除培养基后裂解细胞，取 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


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棕榈酸对总 EIF2α 和磷酸化 EIF2α（Ser52）的药效作用

采用双板检测方案，用棕榈酸 - 牛血清白蛋白（BSA）偶联溶液对 HepG2 细胞进行剂量反应实验。随后在 37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的棕榈酸 / BSA 处理细胞 6 小时。加入裂解缓冲液后，取 16 µL 裂解物两次转移至低体积白色微孔板中，最后添加磷酸化 EIF2α 或总 EIF2α 检测抗体。记录 HTRF 信号，通过双向方差分析（2-way ANOVA）检验，结果表明棕榈酸可显著增加 EIF2α 在 Ser52 位点的磷酸化水平。


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简化通路

EIF2α 的功能与调控

真核起始因子 2（EIF2）在蛋白质翻译起始过程中必不可少，它能将起始甲硫氨酰 tRNA 转移至核糖体的 40S 核糖体亚基。在多种细胞应激条件下，EIF2α 亚基的磷酸化是下调整体蛋白质合成的一种机制，这使细胞能够节省资源，同时启动新的基因表达程序以减轻应激损伤。细胞应激包括内质网应激、氨基酸缺乏或氧化应激等多种类型。有四种激酶可响应不同类型的应激而磷酸化 EIF2α：HRI（红细胞中血红素缺乏）、GCN2（氨基酸缺乏和营养剥夺）、PKR（病毒感染）和 PERK（内质网应激）。


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规格参数


其他规格

  • 应用领域：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 兼容裂解缓冲液：
    • 1 号裂解缓冲液
    • 4 号裂解缓冲液
    • 5 号裂解缓冲液
  • 分子修饰类型：总蛋白
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16 µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷酸化蛋白
  • 靶标物种：
    • 人
    • 小鼠
  • 技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 治疗领域：
    • 代谢 / 糖尿病
    • 非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
  • 单位规格：10,000 个检测点


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y", "SF Pro Icons", "PingFang SC", "Hiragino Sans GB", "Microsoft YaHei", "Helvetica Neue", Helvetica, Arial, sans-serif; text-wrap-mode: wrap; background-color: rgb(255, 255, 255); color: rgba(0, 0, 0, 0.85) !important;">HTRF 总 Wee1 检测能有效检测多种人类和小鼠细胞模型中的 Wee1。

HTRF 总 Wee1 检测与蛋白质印迹法的比较

将人胚肾 293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂ 条件下培养至汇合状态。


移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。


使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和每种稀释液转移到 384 孔小体积微孔板中，然后添加 4µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


将等量的裂解物上样到凝胶中，用于 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。


在这些条件下，HTRF 总 Wee1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

简化通路

总 Wee1 信号通路

Wee1 是丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族成员，在细胞周期调控中发挥重要作用。


为确保细胞周期事件的阶段和协同性，CDK 的激活尤为重要。CDK / 细胞周期蛋白复合物调控细胞周期各个阶段的启动和进展，从而控制细胞增殖和凋亡。细胞周期停滞或延迟可在 S 期内以及 G1 到 S 期和 G2 到 M 期的转换过程中诱导产生。


响应 DNA 损伤时，Wee1 的活性会被上调，以促进细胞周期停滞，阻止细胞进入下一个细胞周期阶段，直至 DNA 复制或修复完成。


在 G2/M 细胞周期检查点，Wee1 磷酸化 Cdk1 的 Tyr15 位点并抑制其活性。在 S 期，Wee1 磷酸化 CDK2 的 Tyr15 位点。起拮抗作用的磷酸酶 CDC25 会去除这种抑制性磷酸化，从而激活 CDK1 或 CDK2 并促进有丝分裂进入。Wee1 与 CDC25 活性的平衡决定了有丝分裂进入和细胞分裂的时间。


许多癌症存在 G1/S 检查点缺陷，这通常与 p53 突变有关。因此，抑制或降解 Wee1 会导致 G2/M 检查点失效，并能使肿瘤对 DNA 损伤策略敏感。

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