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当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > HTRF (H/M) SMARCA4 TOTAL KIT - 500 PTS 总人源/鼠源SWI/SNF染色质重塑复合物的催化ATP酶亚基4检测试剂盒，500

  • HTRF (H/M) SMARCA4 TOTAL KIT - 500 PTS 总人源/鼠源SWI/SNF染色质重塑复合物的催化ATP酶亚基4检测试剂盒，500
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HTRF (H/M) SMARCA4 TOTAL KIT - 500 PTS 总人源/鼠源SWI/SNF染色质重塑复合物的催化ATP酶亚基4检测试剂盒，500

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品牌： Revvity

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概述


SMARCA 基因亚组属于 SWI/SNF 家族，参与染色质重塑和 DNA 损伤修复过程。SWI/SNF 复合物可调控参与 DNA 复制、损伤修复及细胞增殖等关键生命过程的基因。
SMARCA4/BRG1 功能缺失常与癌症相关，且在 SMARCA4 缺陷型癌症中，SMARCA4 与 SMARCA2/BRM 之间的合成致死关系已得到明确证实 —— 即 SMARCA2 失活会导致肿瘤细胞死亡。
在已开展研究的癌症治疗策略中，靶向蛋白降解技术有望克服传统小分子药物的部分局限性。目前，研究人员已开发出蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）分子，用于诱导 SMARCA 蛋白的选择性降解。然而，SMARCA2 与 SMARCA4 在蛋白质水平上约有 75% 的同源性，因此这类化合物往往会同时靶向两种蛋白。基于此，必须对靶向 SMARCA2 或 SMARCA4 的化合物的选择性进行严格研究。在这类研究中，HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒可作为 HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒的重要配套工具，助力实现可靠的化合物谱分析。


工作原理

总 SMARCA4 检测原理

HTRF 总 SMARCA4 检测可对细胞裂解液中 SMARCA4 蛋白的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。
总 SMARCA4 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 SMARCA4 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMARCA4 时，加入这两种抗体偶联物后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 SMARCA4 蛋白的浓度直接成正比，可在免洗涤检测模式下实现对该蛋白表达水平的评估。


总检测原理

总 SMARCA4 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入总 SMARCA4 HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。


磷酸化总检测方案

总 SMARCA4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMARCA4 蛋白时，可在单个培养板中完成所有操作 —— 该培养板可同时用于细胞培养、刺激处理及裂解，无需洗涤步骤。此高通量筛选（HTS）专用方案可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

SMARCA4 总检测方案


检测验证

利用 SMARCA4 基因敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 SMARCA4 检测的特异性

采用 HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒，在 HAP1 细胞（野生型）及 SMARCA4 或 SMARCA2 基因敲除的不同 HAP1 细胞系中检测 SMARCA4 的表达水平。实验前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测信号处于试剂盒的动态检测范围内（相关数据未展示）。
将不同细胞系以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升（µL）1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液裂解细胞，随后取 16 微升细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混合的检测试剂。在室温（RT）下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。
结果显示：在 SMARCA4 基因敲除 HAP1 细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线标注）相当，表明 SMARCA4 基因已完全沉默；而正如预期，在其他细胞系中可检测到正常的 SMARCA4 表达水平。
值得注意的是，野生型 HAP1 细胞与 SMARCA2 基因敲除 HAP1 细胞中 SMARCA4 的表达水平相近，这表明尽管 SMARCA2 与 SMARCA4 的序列同源性超过 70%，HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒仍对 SMARCA4 具有特异性。
所用细胞系目录编号（购自 Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；SMARCA4 基因敲除 HAP1 细胞 #HZGHC000922c003；SMARCA2 基因敲除 HAP1 细胞 #HZGHC004055c008


SMARCA4 总药物检测验证

在多种人源及鼠源细胞系中的验证

将贴壁生长的人源细胞系 HeLa 细胞（宫颈癌细胞系）、HEK293 细胞（肾细胞系）及鼠源细胞系 NIH3T3 细胞以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升 1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
将悬浮生长的人源细胞系 HEL92.1.7 细胞（红白血病细胞系）和 MOLT-4 细胞（T 淋巴细胞白血病细胞系）以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度、30 微升体系接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时，随后用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
采用 HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒检测 SMARCA4 的表达水平：简要步骤为，取 16 微升细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。虚线代表非特异性 HTRF 信号。注：实验前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测信号处于试剂盒的动态检测范围内（相关数据未展示）。
结果显示，HTRF 总 SMARCA4 检测可有效检测不同细胞模型中内源性 SMARCA4 的表达（这些细胞模型中 SMARCA4 的表达水平存在差异）。


SMARCA4 药物检测验证

PROTAC 诱导的 SMARCA4 降解实验

将 HEL92.1.7 细胞以 1×10⁵个细胞 / 30 微升体系接种到 96 孔板中，用浓度递增的 PROTAC 化合物 ACBI1、AU-15330 处理细胞，同时以 PROTAC 化合物 ARV-471（雌激素受体 PROTAC）作为无关阴性对照。孵育过夜后，用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 总 SMARCA4 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。
结果显示：两种 SMARCA4 PROTAC 降解剂处理细胞后，SMARCA4 蛋白水平呈剂量依赖性下降；而在 ARV-471 对照处理组中，SMARCA4 的表达水平及 ATP 水平均保持稳定。上述结果表明，PROTAC 可诱导 SMARCA2 的特异性降解，其 DC50 * 值处于纳摩尔（nM）级，与预期一致（Farnabay, W. 等，《自然化学生物学》，2019 年；Xiao, L. 等，《自然》，2022 年）。
* 注：DC50 指使 50% 的靶蛋白发生降解时所需降解剂的浓度。


SMARCA4 检测验证

SMARCA4 检测验证

PROTAC 对 SMARCA4 与 SMARCA2 的作用谱分析

SMARCA4 总药物检测验证

SMARCA4 总药物检测验证

在 SMARCA4 突变型癌症中，SMARCA2 的选择性降解会诱导合成致死效应，这一过程具有重要意义。
将 HEL92.1.7 细胞以 1×10⁵个细胞 / 孔的密度、30 微升体系接种到 96 孔板中，用浓度递增的 PROTAC 化合物 ACBI1、AU-15330 处理细胞。孵育过夜后，用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 检测抗体（分别使用总 SMARCA2 或总 SMARCA4 检测试剂）。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。
结果显示：ACBI1 和 AU-15330 可诱导 SMARCA2 和 SMARCA4 的水平呈剂量依赖性下降；在相同实验条件下，ATP 水平保持稳定（相关数据未展示）。上述结果与 Farnabay, W. 等（《自然化学生物学》，2019 年）及 Xiao, L. 等（《自然》，2022 年）的研究结论一致。
ACBI1 的已知靶向蛋白为 SMARCA2、SMARCA4、PBRM1，E3 连接酶配体为 VHL 配体，对总 SMARCA2 的 DC50（纳摩尔）为 224，对总 SMARCA4 的 DC50（纳摩尔）为 231；AU-15330 的已知靶向蛋白为 SMARCA2、SMARCA4、PBRM1，E3 连接酶配体为 VHL 配体，对总 SMARCA2 的 DC50（纳摩尔）为 242，对总 SMARCA4 的 DC50（纳摩尔）为 620。

HTRF 总 SMARCA4 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将 HEL92.1.7 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养，置于 37°C、5% 二氧化碳环境下。孵育 24 小时后，移除培养基，用 3 毫升 1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
用 1 号补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 总 SMARCA4 检测试剂。
取等量裂解液进行蛋白质印迹实验，与 HTRF 检测结果进行平行对比。
结果显示，在该实验条件下，HTRF 总 SMARCA4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。


SMARCA4 总药物检测

简化通路：SMARCA4 信号通路

SMARCA2 与 SMARCA4 是 SWI/SNF 复合物中的催化亚基，参与 DNA 转录和修复过程。SMARCA2 与 SMARCA4 包含 6 个不同的结构域，其中包括 DNA 依赖性 ATP 酶结构域和溴结构域（Bromo 结构域）。溴结构域及组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）水平可调控 DNA 与 SWI/SNF 复合物的结合，而 ATP 酶结构域则负责催化 DNA 双链的解旋。
上述功能会受到多梳抑制复合物 2（PRC2）中 EZH2 催化亚基的拮抗 ——EZH2 可抑制基因转录。当 SMARCA2 或 SMARCA4 功能缺失时，DNA 损伤会加剧，这是因为 PRC2 会持续结合到核小体上，抑制 DNA 修复过程。

SMARCA4 磷酸化通路


规格参数


  • 应用领域：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
  • 裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
  • 分子修饰类型：总蛋白（Total）
  • 产品类别：试剂盒
  • 样本体积：16 微升（µL）
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶点类别：磷酸化蛋白
  • 靶点物种：人
  • 技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
  • 单位规格：500 个检测点


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ht); margin-top: var(--md-box-samantha-h4-margin-top); overflow-anchor: auto; font-family: Inter, -apple-system, BlinkMacSystemFont, "Segoe UI", "SF Pro SC", "SF Pro Display", "SF Pro Icons", "PingFang SC", "Hiragino Sans GB", "Microsoft YaHei", "Helvetica Neue", Helvetica, Arial, sans-serif; text-wrap-mode: wrap; background-color: rgb(255, 255, 255); margin-bottom: var(--md-box-samantha-h4-margin-bottom) !important; padding-bottom: 0px !important;">3 种 CREBBP/p300 PROTAC 的剂量效应和时间进程研究
实验在 HeLa 细胞上进行，方法与上一节所述相同，不同之处在于用不同浓度的每种 CREBBP/p300 PROTAC（或弹头 GNE-781）处理细胞 4 小时或 20 小时。如前所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 CREBBP 和总 p300，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。


三种 PROTAC 均诱导 CREBBP 和 p300 的剂量依赖性降解，而弹头 GNE-781 则无此作用。这些化合物对两种蛋白质的作用相近（如效力和动力学）。两种处理时间后，三种降解剂的效力排名相同，其中沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的效力分别是 PROTAC CBP/p300 Degrader-1 的 4 倍和 dCBP-1 的 10 倍（基于 DC50 值）。处理 20 小时后，PROTAC CBP/p300 Degrader-1 和 dCBP-1 的效力显著提高（2.5 至 5 倍），沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 的降解效率也从 65% 提高到 80%。值得注意的是，即使处理 20 小时，这些化合物也未诱导明显的细胞毒性作用（ATPlite 1step 检测，数据未显示）。


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总 CREBBP 和总 p300 检测特异性的验证

将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（总 CREBBP 检测为每孔 50,000 个细胞，总 p300 检测为每孔 12,500 个细胞），使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，用针对人 CREBBP 或其同源物人 p300 的 ON-TARGETplus SMARTPool siRNA 转染细胞，同时使用非靶向 siRNA 作为阴性对照。用 siRNA 孵育 24 小时后，更换培养基再孵育 24 小时，然后用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解后，如第一部分所述，使用相应的 HTRF 试剂盒检测总 CREBBP 和总 p300，并使用 ATPlite 1step 发光试剂盒测量细胞活力。


siRNA 实验表明，HTRF 总 CREBBP 和总 p300 试剂盒均能特异性检测目标蛋白质，而不会识别该家族的另一个成员。用 CREBBP siRNA 处理使总 CREBBP 检测的信号降低 70%，而敲低 p300 并未导致该检测的信号降低。相反，用 p300 siRNA 处理使总 p300 检测的信号降低 86%，而沉默 CREBBP 基因并未导致该检测的信号降低。在 CREBBP 和 p300 siRNA 存在的情况下，ATPlite 发光信号保持稳定，表明 HTRF 信号的降低与细胞毒性作用无关。


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不同人源和鼠源细胞系中总 CREBBP 水平的评估

实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将人源细胞系 SH-SY5Y、MCF7、HeLa、A431 和 A549，以及鼠源细胞系 NIH-3T3 和 Neuro-2a 接种到 96 孔培养板中（每孔 100,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。次日，用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，再加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 试剂盒检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


HTRF 总 CREBBP 试剂盒适用于人源和鼠源细胞模型，能有效检测不同表达水平细胞系中的 CREBBP。


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HTRF 总 CREBBP 检测与蛋白质印迹法（WB）的比较

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，在含完全培养基的条件下于 37°C、5% CO₂环境中培养，直至汇合度达到约 90%。用 3 mL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，并用补充的裂解缓冲液对裂解物进行系列稀释。为检测总 CREBBP，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，并加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 检测试剂。取等量裂解物进行蛋白质印迹法检测，与 HTRF 检测进行平行比较。


使用 HTRF 总 CREBBP 检测时，仅需每孔 500 个细胞即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该条件下，HTRF 总 CREBBP 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


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简化通路

CREBBP/p300 信号通路

转录共激活因子 CREBBP 和 p300 通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和其他转录调节因子（如转录因子 c-Myc、p53 和 FoxO1）进行乙酰化，来调节基因表达。


CREBBP 和 p300 是许多由细胞内或细胞外信号激活的重要信号通路的核心。它们调控生长因子和激素信号传导，如由核激素受体 AR（雄激素受体）和 ER（雌激素受体）介导的信号传导。其他信号示例包括缺氧、细胞应激（涉及 MAP 激酶 p38、JNK 和 ERK）、高血糖、GPCR 激动剂（诱导 cAMP 信号传导）和细胞因子（由 JAK/STAT 通路介导）。CREBBP/p300 还调控 TLR/IRF-3 通路，以控制先天免疫应答。CREBBP 和 p300 均是 BRD4 占据位点（如 H3K27ac）的组蛋白乙酰化所必需的，也是 BRD4 结合到基因启动子和增强子以调控相关基因转录所必需的。


所有这些通路最终都利用细胞核中的 CREBBP 和 p300 作为下游效应器，来控制关键的细胞功能，如细胞周期调控和分化、胚胎发育和稳态。


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