AL346S

HeLa 细胞中碱性磷酸酶对 CDK2 Tyr15 的去磷酸化作用

将人 HeLa 细胞和小鼠 NIH-3T3 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后分别用细胞周期阻滞剂阿非迪霉素和诺考达唑处理 16 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，阿非迪霉素（可将细胞阻滞在 S 期早期）诱导抑制性位点 Tyr15 处的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性积累。

相反，诺考达唑（可将细胞阻滞在 G2/M 期交界处）诱导 Tyr15 位点的 CDK2 磷酸化呈剂量依赖性降低。

无论细胞如何处理，该激酶的表达水平都保持相对稳定。

阿非迪霉素对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的调节作用

诺考达唑对 NIH-3T3 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的调节作用

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 Wee1 激酶抑制剂 Adavosertib 和 PD0166285 处理 2 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，两种 Wee1 激酶抑制剂都触发了 Tyr15 位点的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性降低，而蛋白质的表达水平不受这些处理的调节。

Adavosertib 对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的抑制作用

PD0166285 对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的抑制作用

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 CDK2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 CDK2 检测时，800 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 1,600 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。

HTRF 总 CDK2 试剂盒与蛋白质印迹法的比较

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导细胞周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，从而导致活性 CDK4/6 - 细胞周期蛋白 D 复合物的形成。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 蛋白仍与转录因子 E2F 结合，但一些基因（如细胞周期蛋白 E）可以被转录。在 G1 期晚期和 S 期早期，细胞周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活它，进而使 RB 蛋白上的其他位点磷酸化，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导，例如细胞周期蛋白 A，它随后与 CDK2 相互作用形成细胞周期蛋白 A/CDK2 复合物。激活的 CDK2 最终使 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶磷酸化，而这两种磷酸酶又会激活 CDK1，CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程所必需的。

总 CDK2 信号通路

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ALPHALISA HIL-17A, 0.3 ?G (LYOPHILIZED)

使用细胞周期阻滞剂调节磷酸化 CDK2（Tyr15）

使用 Wee1 激酶抑制剂抑制磷酸化 CDK2（Tyr15）

HTRF 总 CDK2 检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

CDK2 在细胞分裂周期中的作用

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