CAR-T细胞是通过基因工程技术对T细胞进行基因改造，使其表面表达能够识别特定肿瘤抗原的CAR，这种改造使得CAR-T细胞能够精确识别和攻击肿瘤细胞，而不会影响到正常的细胞，从而减少了副作用。但CAR-T细胞疗法也存在一些局限性，如CAR-T细胞相关毒性、耐药性与有限的持久性、抗原逃逸等。瑞孚迪基于  HTRF 和 Alpha 均相免疫检测平台、生物化学发光 Lite 技术以及DELFIA时间分辨荧光技术，在CAR-T细胞的研发阶段，可助您进行表征嵌合受体scFv的结合能力、评估 CAR的转导效率、测量T细胞增殖和毒性以及评估CAR-T疗法的效应细胞功能等，提升您CAR-T细胞治疗安全性和有效性。

一、CAR分子筛选和优化

CAR-T细胞与抗原的亲和力显著影响CAR-T细胞的靶向杀伤能力，过高的亲和力可能会带来CAR-T 细胞相关毒性，过低的亲和力则会导致无法有效与靶标结合，目前，通常使用scFv或者VHH作为CAR的抗原结合区域，因此，scFv或者VHH分子的亲和力是重要的表征和优化点。

针对scFv或者VHH的筛选和亲和力优化，瑞孚迪提供HTRF和Alpha均相检测试剂，您可以根据您靶点蛋白的标签以及scFv或者VHH，选择合适的供体和受体对，自己搭建合适的基于HTRF/Alpha的scFv或者VHH筛选模型。

抗原筛选toolbox试剂（部分）

二、CAR转导效率检测

CAR转导效率的评估是CAR-T细胞疗法研究与应用中的关键环节。转导效率直观地反映了基因工程改造T细胞的成功程度，对于CAR-T细胞的质量控制和治疗效果预测至关重要。评估CAR转导效率主要通过多种技术手段相结合来实现，瑞孚迪可提供基于萤火虫荧光素酶报告基因体系的检测试剂。

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三、体外活性分析

CAR-T细胞体外活性检测可通过体外试验研究CAR-T细胞的增殖能力、对肿瘤细胞的杀伤能力以及体外细胞因子释放等，预测CAR-T细胞在体内的抗肿瘤效果以及潜在的细胞因子风暴风险，从而为CAR-T的临床治疗方案的制定提供依据，提高治疗成功率。

瑞孚迪可提供一系列CAR-T细胞体外活性检测试剂，提供支持细胞样本的高通量检测和定量方案。

1. T细胞增殖能力检测

① 基于DNA合成的检测方法

该方法利用胸腺嘧啶核苷类似物BrdU掺入到S期细胞合成的DNA中，通过Eu标记的特异性抗体结合并检测发光信号。

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② 基于细胞分裂的检测方法

Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，在细胞周期的G1期、S期、G2期和M期均有表达，而在G0期不表达。瑞孚迪HTRF均相检测技术，可通过一对特异性供体和受体抗体对检测T细胞中Ki-67抗原的表达水平，光值越高，则表达Ki-67的T细胞比例越高，说明细胞处于增殖期的数量越多，进而反映T细胞的增殖能力越强。

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2. T细胞杀伤能力检测

免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价一般会涉及免疫细胞和肿瘤细胞两种细胞，因此不能采取基于ATP的检测手段，瑞孚迪提供荧光素酶报告基因检测和EuTDA细胞毒法，以供大家选择进行胞杀伤能力检测。

① 报告基因法

将荧光素酶报告基因导入靶细胞，活的靶细胞会表达荧光素酶，加入荧光素酶报告基因检测试剂后释放出光信号，活的靶细胞数量与释放出的光信号成正比，从而可以评判免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

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② EuTDA细胞毒法

乙酰酯化的BATDA能迅速进入靶细胞，并在水解作用下形成TDA留在靶细胞内，在细胞受到损伤后释放到胞外的TDA与荧光探针Eu3+形成Eu-TDA 复合物，通过检测Eu-TDA的时间分辨荧光信号，来评价免疫细胞对肿瘤细胞的特异杀伤活性。

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③ 细胞死亡途径相关生物标志物检测

人Perforin-1和Granzyme B检测试剂盒均采用HTRF均相检测法，反应原理类似，以人Perforin-1试剂盒为例，该试剂盒含有两种特异性抗人穿孔素抗体，它们分别用Eu穴状化合物（供体）和 D2（受体）进行标记。信号强度与样本中存在的穿孔素浓度成正比。

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3. 检测细胞因子分泌

CAR-T细胞在识别并结合靶细胞抗原后，会被激活并启动一系列免疫反应，细胞因子的分泌水平与 CAR-T细胞的功能状态紧密相关，是判断CAR-T细胞是否正常发挥免疫效应功能的关键指标之一。

检测细胞因子的释放情况可以间接评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。同时，CAR-T细胞治疗可能会引发细胞因子释放综合征（CRS），这是一种严重的不良反应，其主要特征是体内细胞因子水平的急剧升高。在体外活性检测中，通过监测细胞因子的产生，可以提前评估 CAR - T 细胞可能引发的免疫反应强度。

瑞孚迪为您提供一系列均相免洗的细胞因子检测方案，试剂盒涵盖了几乎所有类型的细胞因子：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。

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4. T细胞受体细胞信号传导分析

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三、检测方法建立及质量控制

1. 病毒滴度检测

P24蛋白的检测和定量常用于慢病毒载体的生产和质控，以及相关的感染力评价研究。瑞孚迪基于AlphaLISA和HTRF技术平台，提供P24蛋白高通量检测试剂盒。相比传统ELISA，均相检测方法拥有约4个检测范围的线性区间，有效减少样本的稀释倍数，从而减少稀释、洗板等过程导致的结果偏差，提高结果的准确度。

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2. T细胞质量检测

①细胞因子检测

CAR-T细胞在识别并结合靶细胞抗原后，会被激活并启动一系列免疫反应，细胞因子的分泌水平与 CAR-T细胞的功能状态紧密相关，是判断CAR-T细胞是否正常发挥免疫效应功能的关键指标之一。

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②细胞杀伤检测

报告基因法

将荧光素酶报告基因导入靶细胞，活的靶细胞会表达荧光素酶，加入荧光素酶报告基因检测试剂后释放出光信号，活的靶细胞数量与释放出的光信号成正比，从而可以评判免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

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② EuTDA细胞毒法

乙酰酯化的BATDA能迅速进入靶细胞，并在水解作用下形成TDA留在靶细胞内，在细胞受到损伤后释放到胞外的TDA与荧光探针Eu3+ 形成Eu-TDA 复合物，通过检测Eu-TDA 的时间分辨荧光信号，来评价免疫细胞对肿瘤细胞的特异杀伤活性。

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③ 细胞死亡途径相关生物标志物检测

人Perforin-1和Granzyme B检测试剂盒均采用HTRF均相检测法，反应原理类似，以人Perforin-1试剂盒为例，该试剂盒含有两种特异性抗人穿孔素抗体，它们分别用Eu穴状化合物（供体）和 D2（受体）进行标记。信号强度与样本中存在的穿孔素浓度成正比。

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四、体内动物试验

在药物研发和IND申报前，必须在临床前研究中探索药物的安全性和有效性。临床前药物研究除了体外试验外，还需要使用动物进行体内试验，体外研究一般是基于蛋白和细胞水平，而体内研究能够为药物对整个身体的影响提供依据，更好地可视化潜在的相互作用。

1. 体内药效

动物体内药效试验一般采用目标适应症的动物疾病模型，通过合理的方案设计，来评价药物的有效性，包括药物作用机制的解释，是新药研发中不可或缺的环节，通常用于支持临床试验中产品拟定用途的合理性。

① 药物作用机制研究

抗体药的作用机制较为复杂，通过体内机制研究可以详细了解药物是如何在生物体内复杂的生理环境下发挥作用的，从而深化药物作用原理，通过药物体内作用机理的研究，还可以优化药物设计和开发、预测和避免不良反应以及指导联合用药策略。

磷酸化蛋白检测是抗体药作用机制研究的重要指标之一，瑞孚迪提供全面的磷酸化蛋白检测试剂盒，几乎覆盖了所有磷酸化热门靶点，除了磷酸化蛋白检测试剂盒外，瑞孚迪还提供相应的总蛋白检测试剂盒，让您的检测结果更具客观性。

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② 小动物活体成像

小动物活体成像技术主要包括生物发光（Bioluminescence）和荧光（Fluorescence）成像两种技术，瑞孚迪为您提供种类丰富的生物发光及荧光活体成像试剂，不仅适用于瑞孚迪全系列小动物活体光学成像系统， 而且适用于其他进行体外研究的细胞显微成像系统，帮助您获取从体外到体内研究的系统性实验结果。

产品详情请点击>>  http://puna.021team.com/xiaodongwuhuotichengxiang/

2.安全性研究

细胞因子检测

CAR-T细胞疗法最大的副作用是导致细胞因子释放综合征（CRS）。CRS 是一种严重的、可能危及生命的不良反应，通过监测细胞因子在体内的动态变化，可以及时发现CRS的发生风险。

瑞孚迪提供基于HTRF和Alpha均相检测的细胞因子检测试剂盒，用几ul的样本在2h内即可获得检测结果。

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