HTRF SMAD1 P-S463/465 KIT - 50K PTS

概述

这种基于HTRF细胞的检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸463/465（Ser463/465）位点磷酸化的SMAD1。SMAD1磷酸化后转运至细胞核，作为转录因子调控涉及干细胞更新、细胞增殖、凋亡、迁移、分化及免疫反应的基因表达。工作原理

磷酸化SMAD1（Ser463/465）检测原理 磷酸化SMAD1（Ser463/465）检测用于测量Ser463/465位点磷酸化的SMAD1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化SMAD1（Ser463/465）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 磷酸化SMAD1（Ser463/465）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入磷酸化SMAD1（Ser463/465）HTRF检测试剂。此方案可监测细胞的活力和汇合度。 2-assay-protocol.svg（2-检测方案.svg） 磷酸化SMAD1（Ser463/465）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化SMAD1（Ser463/465）可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 3-assay-protocol.svg（3-检测方案.svg）检测验证

在小鼠C2C12细胞上使用磷酸化Smad1细胞检测的HTRF方法与蛋白质印迹法的比较 将小鼠C2C12细胞培养至80%汇合度。经BMP-4处理后，裂解细胞，离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将16µL各稀释液转移至384孔小体积白色微孔板中，最后加入磷酸化检测试剂盒试剂。对比结果显示，HTRF磷酸化检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的8倍，且具有极佳的相关性。 4phospho-s463-465-3.png（4磷酸化-s463-465-3.png） 5phospho-s463-465-4.svg（5磷酸化-s463-465-4.svg） 在小鼠和人细胞系上对HTRF磷酸化SMAD1（Ser463/465）细胞检测的验证 将细胞接种到96孔板中，在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。经BMP-4处理30分钟后，加入50µL裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，加入4µL HTRF磷酸化SMAD1（Ser463/465）检测试剂。孵育4小时后记录HTRF信号。人宫颈癌HeLa细胞以50,000个细胞/孔的密度接种，并用人类BMP-4处理；小鼠成肌细胞C2C12细胞以25,000个细胞/孔的密度接种，并用小鼠BMP-4处理。 6phospho-s463-465-1.svg（6磷酸化-s463-465-1.svg） 7-s463-465-2.svg（7-s463-465-2.svg）规格参数

其他规格 - 应用领域：细胞信号传导 - 品牌：HTRF - 检测方式：HTRF - 分子修饰：磷酸化 - 产品类别：试剂盒 - 样品体积：16µL - 运输条件：干冰运输 - 目标类别：磷酸化蛋白质 - 目标物种：人、小鼠 - 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） - 治疗领域：心血管疾病、肿瘤学/炎症 - 单位规格：50,000个检测点