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HTRF ADV.ERK P-T202/Y204 KIT - 50K PTS

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概述

高级磷酸化 ERK 检测试剂盒旨在对苏氨酸 202 / 酪氨酸 204（Thr202/Tyr204）位点的 ERK 磷酸化进行稳定且高灵敏度的定量分析，可作为 MAPK 通路的读数指标。其简单的 “混合即读” 流程省去了所有洗涤步骤，能实现更快速的分析并获得高质量结果。总 ERK1/2 检测与磷酸化或高级磷酸化 ERK 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一裂解物可用于分析总蛋白和磷酸化蛋白群体。该试剂盒是 G 蛋白偶联受体（GPCR）和受体酪氨酸激酶（RTK）靶向筛选的理想选择。

工作原理

高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）检测原理

磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）检测用于测量在 Thr202/Tyr204 位点发生磷酸化的 ERK。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则不依赖蛋白质的磷酸化状态进行识别。当蛋白质发生磷酸化时，两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式即可评估蛋白质的磷酸化状态。

高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）双板检测方案

双板方案的流程为：在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）可在单个微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

高级磷酸化 ERK 相较于蛋白质印迹法的独特灵敏度

将 HEK293 细胞培养 48 小时，然后用 50 nM 表皮生长因子（EGF）刺激 5 分钟。移除培养基并裂解细胞后，收集细胞裂解物并离心 10 分钟。对裂解物进行系列稀释，同时通过蛋白质印迹法和 HTRF 高级磷酸化 ERK 检测进行分析。使用 HTRF 高级磷酸化 ERK（Thr202/Tyr204）检测时，仅需 300 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞才能产生信号。HTRF 高级磷酸化 ERK 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 30 倍，且具有极佳的相关性。

无需刺激时抑制剂对基础磷酸化 ERK 的剂量反应

高级磷酸化 ERK 检测能够研究 MAPK 通路抑制剂化合物对基础活化水平的影响，无需对通路进行刺激。由于其高交叉反应性，高级磷酸化 ERK 检测与多种模型物种高度兼容，包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、仓鼠、水貂、牛、猪、黑腹果蝇和斑马鱼。所有实验均采用贴壁细胞的双板检测方案：接种一天后，所有细胞系均用相应抑制剂在 37°C、5% CO₂条件下处理 30 分钟。

糖尿病模型和患者血细胞中 ERK 磷酸化的调节

高级磷酸化 ERK 检测试剂盒非常适合监测胰腺 β 细胞系或患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的激动剂刺激。实验在两种胰腺 β 细胞系（Ins-1E 和 Min6）上进行，采用双板检测方案：两种细胞系均以 70,000 个细胞 / 孔的密度接种 4 天，洗涤后在不含葡萄糖的克雷布斯 - 林格缓冲液中孵育；饥饿 2 小时后，用葡萄糖刺激细胞。外周血单个核细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种，然后用佛波酯（PMA）在 37°C、5% CO₂条件下刺激 30 分钟。

肿瘤异种移植物中磷酸化 ERK 的灵敏检测

从裸鼠中取出 BxPC-3 胰腺肿瘤异种移植物，研磨并裂解；离心后收集可溶性组分，进行系列稀释，然后使用 HTRF 高级磷酸化 ERK 试剂盒试剂进行检测。

磷酸化 ERK 检测的优化细胞密度

由于高级磷酸化 ERK 检测具有高灵敏度，当预期 ERK 磷酸化水平较高时，建议使用标准细胞系的低细胞密度，以确保在试剂盒的线性范围内操作并获得最佳的信号背景比（S/B）。采用贴壁细胞的双板检测方案，在 HEK293 细胞上用 EGFR 激动剂 EGF 或小分子 Raf 激酶抑制剂 L779-450 进行剂量反应实验：细胞以 25,000、50,000 或 100,000 个细胞 / 孔的密度接种，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。

Gaq/i 偶联受体激活

CHO-CCR5 细胞（25,000 个细胞）用 RANTES 和 MIP-Iβ 激活 10 分钟，采用磷酸化 ERK 细胞检测的双板方案获得结果。

筛选稳健性

CHO-M1 细胞（5,000 个细胞 / 孔，384 孔小体积板）用卡巴胆碱在室温下刺激 10 分钟。在未刺激细胞（基础水平）与两种选定卡巴胆碱浓度（1.3 µM 和 4 µM，分别对应 EC80 和 EC100）之间，计算 50 次重复的 Z' 值。实验采用磷酸化 ERK 试剂盒的单板检测方案，在 CyBio™机器人系统（配备 384/25 µL 移液头的 CyBivario）上进行，结果在 PHERAStar Plus（BMG Labtech）上读取。

总 ERK1/2 检测用于控制 ERK1/2 的磷酸化

A431 细胞（100,000 个细胞 / 孔）用 EGF 激活 10 分钟，采用磷酸化 ERK1/2 和总 ERK1/2 检测的双板方案。结果如预期所示：EGF 刺激后 ERK1/2 磷酸化呈剂量反应性增加，而 ERK1/2 的表达水平保持恒定。

简化通路

MAPK/ERK 细胞信号通路

MAPK/ERK 信号级联可被多种参与生长和分化的受体激活。核心信号转导级联调控众多细胞过程，包括黏附、迁移、凋亡、分化和代谢。MEK1/2 催化 ERK1/2 在 Tyr204 和 Thr202 位点的磷酸化；作为响应，ERK 会磷酸化数百种细胞质和细胞核底物。MAPK 信号的广泛复杂性和多样性使 ERK 成为生物学中关键的调节因子和主要信号节点。

GPCR 信号中的 ERK

ERK 调节在 GPCR 信号中起重要作用，因此是重要的可测量 GPCR 读数指标。GPCR 通过 G 蛋白发挥作用，调控广泛的细胞功能。刺激后，这些受体激活效应器（如腺苷酸环化酶和磷脂酶 C），不仅影响细胞内第二信使（如 cAMP 和 Ca²⁺）的浓度，还介导 ERK1/2 的磷酸化。研究表明，GPCR 还可通过不依赖 G 蛋白但依赖 β- 抑制蛋白的方式介导 ERK1/2 的激活。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标：ERK1/2
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症、罕见病
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64AERPEY

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