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HTRF ANDRO RECEPTOR KIT - 50K PTS

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概述

HTRF 人雄激素受体检测可监测野生型雄激素受体（AR-WT）和雄激素受体剪接变体 7（AR-V7），用于检测各种细胞中内源性或过表达雄激素受体的表达情况。


雄激素受体是一种核受体，可被雄激素（如睾酮（T）和二氢睾酮（DHT））激活。


雄激素与雄激素受体的配体结合域结合，导致受体同源二聚化并转运至细胞核。这会激活下游基因表达和信号通路（如 PI3K/AKT 通路）的激活。雄激素受体诱导的基因表达会引发细胞分裂、增殖、分化、凋亡和血管生成。雄激素受体通路的失调可能导致致癌表型，且雄激素受体的激活或过表达与前列腺癌以及乳腺癌、胶质母细胞瘤等其他类型癌症密切相关。此外，雄激素受体变体在多种人类癌细胞系中表达。雄激素受体变体 7（AR-V7）是雄激素受体 mRNA 的剪接变体，会导致配体结合域截断，具有组成型活性，在人类癌细胞系中广泛表达。因此，雄激素受体已成为制药行业的重要药物靶点。开发靶向雄激素受体降解的 PROTAC 化合物是靶向雄激素受体阳性癌症的治疗策略之一。

工作原理

HTRF 人雄激素受体检测原理

HTRF 人雄激素受体检测可定量细胞裂解物中雄激素受体的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人雄激素受体检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在雄激素受体时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质表达提供了便利。


人雄激素受体双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入人雄激素受体 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


人雄激素受体单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测人雄激素受体可在单个微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。


检测验证

通过 HTRF 和蛋白质印迹法监测细胞中人类雄激素受体的降解

对比了通过蛋白质印迹法和 HTRF 人雄激素受体试剂盒监测 ARCC-4 PROTAC 化合物对雄激素受体的剂量依赖性降解：将人前列腺癌细胞系 LNCaP 以 75,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育；用浓度范围为 5nM 至 10,000nM 的 ARCC-4 PROTAC 化合物处理细胞 24 小时；处理后，用 50µL 补充裂解缓冲液 #3 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟；对于人雄激素受体试剂盒的检测步骤，将 16µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 人雄激素受体检测试剂；孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。HTRF 人雄激素受体试剂盒测定出 ARCC-4 PROTAC 化合物在 LNCaP 细胞中降解人雄激素受体的 DC50（50% 靶蛋白被降解时的浓度）为 900nM。通过蛋白质印迹法评估了 ARCC-4 PROTAC 化合物对 LNCaP 细胞中表达的 AR-WT 和 AR-V7 两种形式的降解情况：结果表明，只有 AR-WT 会被 ARCC-4 PROTAC 化合物降解，这也解释了为何能同时检测两种形式的 HTRF 人雄激素受体试剂盒所监测到的降解是部分降解。ARCC-4 PROTAC 化合物在 LNCaP 细胞中降解人雄激素受体的 DC50 值，在 HTRF 人雄激素受体试剂盒和蛋白质印迹法中是一致的。


HTRF 人雄激素受体检测与蛋白质印迹法的比较

人乳腺癌细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时；用 3mL 补充裂解缓冲液 #3 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟；用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 人雄激素受体检测试剂；使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。使用 HTRF 人雄激素受体检测时，1,500 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 6,500 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 人雄激素受体检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4.5 倍。

简化通路

雄激素受体信号通路

雄激素受体（AR）是一种核受体，可被雄激素（如睾酮（T）和二氢睾酮（DHT））激活。雄激素穿过细胞膜直接与雄激素受体结合，诱导雄激素受体同源二聚化并允许其转运至细胞核。然后，雄激素受体二聚体结合到雄激素应答元件（ARE）上，引发基因表达，进而导致细胞分裂、增殖、分化、凋亡和血管生成。


规格参数

其他规格

  • 应用领域：细胞信号传导
  • 自动化兼容性：是
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16 µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷蛋白
  • 靶标物种：人
  • 技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 治疗领域：肿瘤学与炎症
  • 单位规格：500 个检测点


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将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后移除培养基，用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


不同化合物显示出不同的反应。新制癌菌素、羟基脲和依托泊苷可诱导单链断裂（SSB），导致 CHK1 完全磷酸化。倾向于引发双链断裂（DSB）的阿霉素则使 CHK1 部分磷酸化。新制癌菌素、羟基脲、依托泊苷和阿霉素的半数有效浓度（EC50）分别为 1.2µM、0.1mM、3.3µM 和 7.1µM。


此外，新制癌菌素的 80% 有效浓度（EC80）经测定为 3µM，该浓度被用于评估 ATR/CHK1 通路的抑制剂。


另一方面，这 4 种化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。


human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）


human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）

ATR/CHK1 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂以剂量反应方式在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后用 3µM 新制癌菌素（EC80）在 37°C、5% CO₂条件下再处理细胞 2 小时。移除培养基，然后用 50µl 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。


已知咖啡因是一种温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是一种强效 CHK1 抑制剂，而 KU55933 仅是 ATM 通路抑制剂。正如预期，UCN-1 能以高活性（半数抑制浓度（IC50）为 15nM）完全抑制 CHK1 磷酸化，而咖啡因的活性较弱。KU55933 化合物未诱导 CHK1 磷酸化抑制。


另一方面，这 3 种测试化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。


human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）


human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）

HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。


移除培养基后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1x）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。


使用补充的 1 号裂解缓冲液（1x）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和每种稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化丝氨酸 345 CHK1 检测试剂。过夜后记录信号。


将等量的裂解物上样到凝胶中，对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。


在这些条件下，HTRF 磷酸化丝氨酸 345 CHK1 检测与蛋白质印迹法的灵敏度相当。


human-mouse-phospho-CHK1-detection-kit（人 / 小鼠磷酸化 CHK1 检测试剂盒）


简化通路

ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路

双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是最有害的损伤之一，可能威胁基因组完整性。这类损伤可由细胞代谢物的作用或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）诱导产生。


DNA 损伤应答（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症及 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，它们是磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）蛋白激酶家族的两个成员。


在应对 DNA 损伤（SSBs）时，ATR–Chk1 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G2/M 检查点以阻止细胞周期进程，为 DNA 修复争取额外时间。ATR 通过其相互作用伙伴 ATRIP 被招募到单链 DNA-RPA 复合体处，这会导致 Chk1 磷酸化和激活。CHK1 激活涉及信号转导通路，直至调节 cdc2 / 周期蛋白 B1 活性和控制 Cdc25A。


许多癌症在 G1/S 检查点存在缺陷，包括那些 p53 缺陷的癌症。如果由于 DNA 损伤，G1 检查点缺陷细胞中的 ATR 通路受到抑制，细胞将不会引发细胞周期停滞以进行 DNA 修复，从而导致癌细胞死亡。因此，抑制 ATR 通路已成为一种有吸引力的策略，可选择性地使 p53 缺陷细胞对损伤 DNA 的化疗药物敏感。


创新小分子 Chk1 和 Chk2 抑制剂的鉴定，以及检查点调节新策略与传统放疗和化疗方式相结合的验证，为改善癌症治疗带来了希望。


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