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HTRF (H/M) BRD4 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

BRD4 是一种参与胚胎发生和癌症发展的转录调节因子。与溴结构域和末端外结构域（BET）家族的其他成员（BRD2、BRD3 和 BRDT）一样，BRD4 包含两个溴结构域，可结合组蛋白等蛋白质上的乙酰化赖氨酸残基。BRD4 与细胞周期蛋白 T1（Cyclin T1）和 CDK9 结合，这三种蛋白质共同形成一种名为 P-TEFb 的多蛋白复合物，调控基因转录。除了在转录调控中的作用外，BRD4 还参与 DNA 损伤反应。

抑制 BRD4 的功能是癌症治疗策略的一部分。最近，通过 PROTAC 分子靶向 BRD4 降解已成为一种新颖且极具前景的治疗方法。

工作原理

总 BRD4 检测原理

HTRF 总 BRD4 检测用于定量细胞裂解物中 BRD4 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD4 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD4 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，且在免洗涤的检测格式下为评估蛋白的表达水平提供了手段。

HTRF 总 BRD4 检测原理

总 BRD4 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，之后加入总 BRD4 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD4 双板检测方案

总 BRD4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 BRD4 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD4 单板检测方案

检测验证

在多种人和小鼠细胞系上的验证

将贴壁人细胞系 MCF7、MDA-MB-543 细胞（乳腺）、HELA（宫颈）、SH-SY5Y（骨髓神经母细胞）、HEK-293（胚胎肾）以及小鼠细胞系 NIH3T3 和 Neuro2A 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。

将悬浮免疫人 PL-21 细胞系（急性髓系白血病）以 100,000 个细胞 / 孔的密度、30µL / 孔的量接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10µL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）裂解。

使用 HTRF 总 BRD4 试剂盒评估 BRD4 的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。值得注意的是，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

HTRF 总 BRD4 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD4。

多种细胞系上的总 BRD4 检测验证

PROTAC® 诱导的 BRD4 降解

MCF7 细胞上总 BRD4 检测的药理学验证 ——PROTAC

MCF7 细胞上总 BRD4 检测的药理学验证 ——GAPDH

将 MCF7 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的一系列 PROTAC 化合物处理细胞：dBET6、ARV-771 和 ZXH-3-26，以及作为阴性无关对照的 PROTAC ARV-471（PROTAC 雌激素受体）。过夜孵育后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如预期（Raina 等人，《美国国家科学院院刊》，2019 年；Winter 等人，《分子细胞》，2017 年；Nowak 等人，《自然化学生物学》，2018 年），这三种 BRD4 PROTAC 降解剂触发 BRD4 蛋白呈剂量依赖性减少，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，而在 ARV-471 对照条件下，BRD4 的表达水平保持稳定。

在相同条件下观察到管家基因 GAPDH 信号降低，表明高浓度 PROTAC 可能诱导细胞毒性。

DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证 HTRF 总 BRD4 检测的特异性

将 MCF7 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 BRD1/2/3/4/7/9 和 BRDT 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与阴性 siRNA 相比，BRD4 siRNA 使 BRD4 表达水平降低了 56%，而在其他 BRD siRNA 转染的细胞中，HTRF BRD4 信号保持稳定。值得注意的是，在相同条件下，管家基因 GAPDH 信号未发生变化。这些结果共同证明了 HTRF BRD4 检测的特异性和选择性。

使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——BRD4

使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——GAPDH

HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 总 BRD4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

BRD4 信号通路
BRD4 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合，并招募多种转录共激活因子，促进形成一个大型的转录调节蛋白平台。该复合物进一步在超级增强子和启动子之间形成桥梁，NFKB 和其他转录因子（TF）在此结合。最后，P-TEFb 刺激 RNA 聚合酶 II，进而启动包括 c-Myc 或 K-Ras 等癌基因在内的多个基因的转录。

该示意图改编自 Muddassir 等人，《RSC Advances》，2021 年。

pathway-BRD4-total.svg（BRD4 总检测信号通路图）

规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64BRD4TPEH

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