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HTRF CDK2 P-Y15 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地检测 Tyr15 位点磷酸化的 CDK2。

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（该亚家族还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。CDK2 分别在 G1 期晚期和 S 期通过与细胞周期蛋白 E 和细胞周期蛋白 A 相互作用而被激活，并且还受两个主要磷酸化位点的调控。激酶 Wee1 在 Tyr15 位点的磷酸化会通过阻止 ATP 结合而产生抑制作用，而磷酸酶 Cdc25A 对 Tyr15 的去磷酸化以及 CAK（CDK 激活激酶）在 Thr160 位点的磷酸化则是其完全激活所必需的。

Tyr15 位点的 CDK2 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性和防止 S 期 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/Cdc25A 轴是癌症治疗中一个极具吸引力的靶点，或许代表了一种使具有过度活跃 CDK2 的癌细胞致敏的独特方法。

工作原理

磷酸化 CDK2（Tyr15）检测原理

磷酸化 CDK2（Tyr15）检测用于测量 Tyr15 位点磷酸化的 CDK2。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种抗体，一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。

phospho-CDK2-cellular-kit-1.svg（磷酸化 CDK2（Tyr15）检测原理示意图）

磷酸化 CDK2（Tyr15）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 CDK2（Tyr15）的 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2（Tyr15）双板检测方案示意图）

磷酸化 CDK2（Tyr15）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CDK2（Tyr15）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2（Tyr15）单板检测方案示意图）

检测验证

通过 siRNA 敲低实验验证磷酸化 CDK2（Tyr15）检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（40,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，移除培养基，用 0.5µg/mL 阿非迪霉素处理细胞 20 小时。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 CDK2 siRNA 的细胞信号降低 92%。相反，敲低 CDK1、CDK4 或 CDK6 并未导致任何信号降低，这表明 HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测对 CDK2 的磷酸化具有特异性，且不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（通过 siRNA 敲低实验验证磷酸化 CDK2（Tyr15）检测特异性的结果图）

碱性磷酸酶对 CDK2 Tyr15 的去磷酸化作用

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中培养 48 小时，并用 0.5µg/mL 阿非迪霉素处理 20 小时。然后用 3mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，仅将部分裂解物用碱性磷酸酶（AP）处理。检测步骤中，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，碱性磷酸酶诱导 CDK2 的 Tyr15 位点几乎完全去磷酸化，而该激酶的总水平不受此处理的调节。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（碱性磷酸酶对 CDK2 Tyr15 去磷酸化作用的结果图）

使用细胞周期阻滞剂调节磷酸化 CDK2（Tyr15）

将人 HeLa 细胞和小鼠 NIH-3T3 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后分别用细胞周期阻滞剂阿非迪霉素和诺考达唑处理 16 小时。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，阿非迪霉素（可将细胞阻滞在 S 期早期）诱导抑制性位点 Tyr15 处的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性积累。

相反，诺考达唑（可将细胞阻滞在 G2/M 期交界处）诱导 Tyr15 位点的 CDK2 磷酸化呈剂量依赖性降低。

无论细胞如何处理，该激酶的表达水平都保持相对稳定。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（阿非迪霉素对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）调节作用的结果图）

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit-8.svg（诺考达唑对 NIH-3T3 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）调节作用的结果图）

使用 Wee1 激酶抑制剂抑制磷酸化 CDK2（Tyr15）

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 Wee1 激酶抑制剂 Adavosertib 和 PD0166285 处理 2 小时。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，两种 Wee1 激酶抑制剂都触发了 Tyr15 位点的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性降低，而该蛋白质的表达水平不受这些处理的调节。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit-8.svg（Adavosertib 对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）抑制作用的结果图）

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（PD0166285 对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）抑制作用的结果图）

HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 0.5µg/mL 阿非迪霉素处理细胞 16 小时，然后用 3mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测时，800 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 1,600 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在此条件下，HTRF 磷酸化 CDK2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测与蛋白质印迹法比较的结果图）

简化通路

磷酸化 CDK2 在细胞分裂周期中的作用

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导细胞周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，进而形成有活性的 CDK4/6 - 细胞周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因（如细胞周期蛋白 E）可被转录。在 G1 期晚期和 S 期早期，细胞周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，例如细胞周期蛋白 A，它随后与 CDK2 相互作用形成细胞周期蛋白 A/CDK2 复合物。CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程所必需的。

S 期 CDK2 的活性受到正向和负向调控作用的严格调控：当 CDK2 活性最高时，其 Thr160 位点的磷酸化增加，同时抑制性位点 Tyr15 的磷酸化也达到最大值。因此，在细胞周期中整体 CDK2 活性增加的时期，一部分 CDK2 分子的活性受到抑制。相反，Tyr15 在有丝分裂时突然去磷酸化。

Tyr15 位点的 CDK2 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性以及在 S 期防止 DNA 损伤至关重要。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2（Tyr15）相关通路图）

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64CDK2Y15PEY

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