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HTRF LRRK2 P-S935 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 LRRK2（Ser935）试剂盒可直接在您感兴趣的细胞类型中检测内源性在 Ser935 位点磷酸化的 LRRK2 蛋白。LRRK2 是神经科学研究中的一个重要靶点，涉及帕金森病（PD）及一般的神经退行性疾病。

工作原理
磷酸化 LRRK2（Ser935）检测原理
磷酸化 LRRK2（Ser935）检测用于测量在 Ser935 位点磷酸化的 LRRK2。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 LRRK2（Ser935）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经选择可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式下，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了一种方法。

磷酸化 LRRK2（Ser935）双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解液转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化 LRRK2（Ser935）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 LRRK2（Ser935）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 LRRK2（Ser935）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证
HTRF 磷酸化 LRRK2 检测与蛋白质印迹法的比较
培养小鼠 NIH-3T3 细胞 2 天，直至达到 100% 汇合度。细胞裂解后，离心 10 分钟，收集可溶性组分。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，每种稀释液取 16 µL，分别通过蛋白质印迹法（WB）和 HTRF 进行平行分析。HTRF 磷酸化检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍：使用 HTRF 磷酸化 LRRK2 检测时，仅需 2500 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法则需要 20000 个细胞才能产生信号。

NIH 3T3 细胞中磷酸化 LRRK2 的检测
在 6 孔板中培养细胞，并用浓度递增的 CZC…… 和 GSK…… 处理 2 小时。移除培养基，更换为 Revvity 裂解缓冲液，作用 1 小时。从每个孔中取 16 µL 裂解液，转移到 384 孔板中，用 HTRF 试剂进行检测。Revvity 磷酸化 LRRK2 检测能够清晰测定两种抑制剂的半数抑制浓度（IC50），与文献报道一致。

使用肽段验证磷酸化 LRRK2 检测对 Ser935 磷酸化的特异性
在 T175 培养瓶中，用编码人突变型 LRRK2 G2019S 蛋白的质粒转染 HEK293 细胞 24 小时，然后用 100 nM 花萼海绵诱癌素 A 处理 30 分钟。在室温下，用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液温和振荡裂解细胞 30 分钟。
竞争检测在 384 孔小体积白色微孔板中进行：加入 14 µL 细胞裂解液（预先用补充的裂解缓冲液稀释 100 倍）、2 µL 每种肽段（用补充的裂解缓冲液进行系列稀释）以及 4 µL HTRF 磷酸化 LRRK2（Ser935）检测试剂。在室温下孵育 4 小时后，用 EnVision Nexus 读数仪记录 HTRF 信号。
LRRK2 磷酸化 Ser935 肽段对 HTRF 信号产生了剂量依赖性抑制，而其他肽段存在时信号无变化。这些结果表明，HTRF 检测可特异性检测 LRRK2 上磷酸化的 Ser935 残基。

规格参数

其他规格参数
应用领域
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
分子修饰
磷酸化
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸化蛋白
靶标物种
人
小鼠
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
神经科学
单位规格
50,000 个检测点

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货号：6FLRKPEY

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