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HTRF IKKB P-S177/181 KIT - 10K PTS

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概述

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测试剂盒可直接在完整细胞中检测活化 IKK-β 的 Ser177/181 位点磷酸化水平。该试剂盒采用简化的实验流程，适用于小体积反应体系，可从基础研究扩展至高通量药物筛选。

工作原理

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测原理

磷酸化 IKK-β（Ser177/181）检测用于测定 Ser177/181 位点磷酸化的 IKK-β。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 IKK-β（Ser177/181）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 IKK-β（Ser177/181）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 IKK-β（Ser177/181）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 IKK-β（Ser177/181）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

phospho-ikkbeta-ser177-181-1-plate-assay-protocol

检测验证

HTRF 磷酸化 IKK-β 检测与蛋白质印迹法的比较

HeLa 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天，用 0.5nM IL-1β 刺激 15 分钟。去除细胞培养基后，加入 3mL 补充的裂解缓冲液并孵育 45 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清。取等量裂解物进行蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 的平行比较。结果显示，HTRF 检测的灵敏度高于蛋白质印迹法：HTRF 仅需 12,000 个细胞，而蛋白质印迹法需要 46,000 个细胞。

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TNF-α 对 HeLa 细胞的剂量反应实验

将两种浓度的 HeLa 细胞（100K 和 200K 细胞 / 孔）在 37°C 下与不同浓度的 TNF-α 孵育 15 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测定磷酸化 IKK-β 水平。

assay-validation-ikkb-phospho-s177-181-2

IL-1β 对 HeLa 细胞的剂量反应实验

将两种浓度的 HeLa 细胞（100K 和 200K 细胞 / 孔）在 37°C 下与不同浓度的 IL-1β 孵育 15 分钟。裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测定磷酸化 IKK-β 水平。

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HeLa 细胞中磷酸化与总 IKK-β 的检测实验

将不同密度（200K 和 100K）的 HeLa 细胞以 100µL 体积接种到 96 孔板中并孵育过夜。吸去培养基后，加入 50µL 不同浓度的 IL-1β 孵育 15 分钟。孵育结束后吸去培养基，用 50µL 1X 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 IKK-β（Ser177/181）或总 IKK-β 检测试剂。室温孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。

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简化通路

IKK-β 简化通路

NF-κB 的激活始于信号诱导的 IκB 蛋白降解，这一过程主要通过一种名为 IκB 激酶（IKK）的激酶活化实现。IKK 由 3 个亚基组成异源三聚体，包括 IKK-α 和 IKK-β（两个催化亚基）以及 IKK-γ/NEMO（调节亚基）。活化的 IKK-β 可磷酸化 NF-κB 抑制蛋白 IκB（如 IκBα），而 IκB 通常通过结合 NF-κB 抑制其功能。磷酸化的 IκB 通过泛素化途径降解，释放 NF-κB 使其进入细胞核，激活参与炎症及其他免疫反应的多种基因。此外，IKK-β 在中风后的脑细胞中发挥重要作用。

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规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、神经科学、肿瘤与炎症
单位规格：10,000 次检测

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货号：64KKBPEH

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