当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H/M) CHK1 P-S345 KIT - 50K PTS

HTRF (H/M) CHK1 P-S345 KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_US rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_UK rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_SPA rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_ITA rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_ELL rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_DEU rvty_ls_sds_64CHK1S5PEG_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸 345 位磷酸化的 CHK1，以此作为 DNA 损伤应答（DDR）中 ATR/CHK1 信号通路的读出指标。

在应对 DNA 损伤（例如单链断裂（SSBs））时，ATR-Chk1 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G2/M 检查点以阻止细胞周期进程，为 DNA 修复争取额外时间。ATR 通过其相互作用伙伴 ATRIP 被招募到单链 DNA-RPA 链上，这会导致 Chk1 的磷酸化和激活，进而诱导下游信号传导。

工作原理

HTRF 磷酸化 CHK1 丝氨酸 345 检测原理

磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测用于测量丝氨酸 345 位磷酸化的 CHK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会形成一种免疫复合物，其中包含这两种标记抗体，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 CHK1 丝氨酸 345 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 CHK1 丝氨酸 345 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

人 / 鼠 CHK1 检测的兼容性：新制癌菌素剂量反应曲线

将人 HEK293 细胞或鼠 NIH/3T3 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素对细胞进行剂量反应处理，在 37°C、5% CO₂条件下处理 2 小时。然后用 50µl 补充的 1X 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，新制癌菌素诱导单链 DNA 损伤，导致 CHK1 磷酸化呈剂量依赖性增加，而对人或鼠细胞系中总蛋白的表达水平没有任何影响。

诱导 DNA 损伤的化合物对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷对细胞进行剂量反应处理，在 37°C、5% CO₂条件下处理 2 小时。然后移除培养基，用 50µl 补充的 1X 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

不同化合物显示出不同的反应。新制癌菌素、羟基脲和依托泊苷会诱导单链断裂（SSB），导致 CHK1 完全磷酸化。而倾向于诱导双链断裂（DSB）的阿霉素则使 CHK1 部分磷酸化。新制癌菌素、羟基脲、依托泊苷和阿霉素的半数有效浓度（EC50）分别为 1.2µM、0.1mM、3.3µM 和 7.1µM。

此外，这 4 种化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。

ATR/CHK1 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 CHK1 磷酸化和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂对细胞进行剂量反应处理，在 37°C、5% CO₂条件下处理 2 小时。然后用 3µM 新制癌菌素（EC80）在 37°C、5% CO₂条件下再处理细胞 2 小时。移除培养基，用 50µl 补充的 1X 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）或总 CHK1 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

已知咖啡因是一种温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是一种强效的 CHK1 抑制剂，而 KU55933 仅是 ATM 通路抑制剂。正如预期的那样，UCN-1 能高效抑制 CHK1 磷酸化（半数抑制浓度（IC50）为 15nM），而咖啡因的抑制效力较弱。KU55933 则未诱导 CHK1 磷酸化抑制。

此外，这 3 种受试化合物均未影响 CHK1 总蛋白的表达水平。

HTRF 磷酸化 CHK1（丝氨酸 345）检测与蛋白质印迹法的比较

HEK293 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。

移除培养基后，用 3mL 补充的 1X 1 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的 1X 1 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化丝氨酸 345 CHK1 检测试剂。过夜记录信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，用于 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在此条件下，HTRF 磷酸化丝氨酸 345 CHK1 检测与蛋白质印迹法的灵敏度相当。

简化通路

ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路

双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是最有害的损伤之一，可能威胁基因组完整性。这类损伤可由细胞代谢物的作用或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）诱导产生。

DNA 损伤应答（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症和 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，它们是磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）蛋白激酶家族的两个成员。

在应对 DNA 损伤（SSBs）时，ATR–Chk1 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G2/M 检查点以阻止细胞周期进程，为 DNA 修复争取额外时间。ATR 通过其相互作用伙伴 ATRIP 被招募到单链 DNA-RPA 链上，这会导致 Chk1 的磷酸化和激活。CHK1 的激活涉及信号转导通路，直至调节 cdc2 / 细胞周期蛋白 B1 的活性和控制 Cdc25A。

许多癌症存在 G1/S 检查点缺陷，包括那些 p53 缺陷的癌症。如果因 DNA 损伤导致 G1 检查点缺陷细胞中的 ATR 通路受到抑制，细胞将无法引发细胞周期停滞以进行 DNA 修复，从而导致癌细胞死亡。因此，抑制 ATR 通路已成为一种有吸引力的策略，可选择性地使 p53 缺陷细胞对损伤 DNA 的化疗药物敏感。

创新小分子 Chk1 和 Chk2 抑制剂的发现，以及检查点调节新策略与传统放疗和化疗方式的结合，有望改善癌症治疗。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64CHK1S5PEY

一键复制

参考价格 ¥ 545226.97

产品规格

请咨询￥545226.97

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价