磷酸化 EGFR 检测试剂盒旨在基于细胞对 EGFR 上的 Tyr1068 磷酸化进行定量检测。导致 EGFR(也称为 ErbB1 或 HER1)过表达或过度激活的突变与多种癌症相关,如肺癌、结直肠癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤等。这使得 EGFR 成为抗癌治疗相关免疫检测的关键靶点。
磷酸化 EGFR(Tyr1068)检测用于测定在 Tyr1068 位点发生磷酸化的 EGFR。与蛋白质印迹法不同,该检测完全基于微孔板进行,无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体:一种偶联供体荧光团,另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序,第二种抗体则能独立于磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物,使供体荧光团与受体荧光团靠近,从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比,且在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供了方法。
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双板方案包括:先在 96 孔板中培养细胞,裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板,再加入磷酸化 EGFR(Tyr1068)HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
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使用 HTRF 试剂检测磷酸化 EGFR(Tyr1068)可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成,无需洗涤步骤。这种为高通量筛选(HTS)设计的方案能够实现微型化操作,同时保持稳定的 HTRF 检测质量。
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将人 A431 细胞培养 48 小时,用 100 ng/mL EGF 刺激 10 分钟。裂解后,通过离心收集可溶性组分。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释,取 16 µL 各稀释液分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。使用 HTRF 磷酸化 EGFR(Tyr1068)检测时,仅需 100 个细胞即可检测到最低信号,而蛋白质印迹法需要 3120 个细胞才能产生信号。HTRF 磷酸化 EGFR 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 30 倍,且相关性良好。
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将人 BxPC3 细胞(图 1;绿色)、SKOV3 细胞(图 2;紫色)、CRC1 细胞(图 3)和 A431 细胞(图 4;粉色)接种在 96 孔板中,在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用浓度递增的激动剂孵育 10 分钟后,移除培养基,用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻摇晃 30 分钟以裂解细胞。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中,加入 4 µL HTRF 磷酸化 EGFR 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。
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EGFR 是一种属于 ErbB 家族的受体酪氨酸激酶。EGFR 配体的结合会促使受体同源二聚化或异源二聚化,从而激活 EGFR 酪氨酸激酶结构域和特定的酪氨酸残基。
磷酸化的酪氨酸残基随后为多种因子提供停靠位点,这些因子会诱导多个信号转导级联反应的下游激活。
从 EGF 受体传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能,如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。
导致 EGFR 过表达或过度激活的突变与多种癌症相关,这使得 EGFR 成为抗癌治疗的关键靶点。
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- 应用:细胞信号传导
- 品牌:HTRF
- 检测方式:HTRF
- 兼容的裂解缓冲液:3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
- 分子修饰:磷酸化
- 产品类别:试剂盒
- 样品体积:16 µL
- 运输条件:干冰运输
- 靶标类别:磷蛋白
- 靶标物种:人
- 技术:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
- 治疗领域:肿瘤学与炎症
- 单位规格:500 个检测点