总 SMAD4 细胞检测试剂盒(Total-SMAD4 Cellular Assay Kit)旨在监测 SMAD4 蛋白的表达水平,无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。
该试剂盒可与磷酸化 SMAD4 检测试剂盒(Phospho-SMAD4 Kit)兼容,能够从同一份样本中分析磷酸化 SMAD4 与总 SMAD4 的水平,为转化生长因子 -β(TGF-ß)信号通路活性提供更精准的检测结果。
总 SMAD4 检测可定量细胞裂解液中 SMAD4 蛋白的表达水平。与蛋白质印迹法(Western Blot)不同,该检测为全板基检测,无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。
总 SMAD4 检测采用两种标记抗体:一种偶联供体荧光团,另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMAD4 时,加入这些偶联抗体后,供体荧光团与受体荧光团会近距离接触,进而产生荧光共振能量转移(FRET)信号。该信号强度与样本中 SMAD4 蛋白的浓度直接成正比,可在免洗涤检测模式下评估该蛋白的表达水平。
(图示标注:phospho-how-it-works-smad4-total-assay-principle,即 “总 SMAD4 检测原理”)
双板检测方案的流程为:先在 96 孔板中培养细胞,随后进行细胞裂解,再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板,最后加入总 SMAD4 HTRF 检测试剂。
该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。
(图示标注:phospho-how-it-works-smad4-total-assay-protocol-1,即 “总 SMAD4 双板检测方案”)
使用 HTRF 试剂检测总 SMAD4 蛋白时,可在单个培养板中完成所有操作 —— 该培养板可同时用于细胞培养、刺激及裂解,无需洗涤步骤。
此高通量筛选(HTS)专用方案可在实现实验微型化的同时,保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。
(图示标注:phospho-how-it-works-smad4-total-assay-protocol-2,即 “总 SMAD4 单板检测方案”)
选取 HeLa 细胞系(人宫颈癌细胞系)和 HAPI 细胞系(人小胶质细胞系)验证人源蛋白兼容性,选取 NIH 3T3 细胞系(小鼠胚胎成纤维细胞系)验证鼠源蛋白兼容性。将上述不同细胞系分别以每孔 2.5 万、5 万和 10 万个细胞的密度接种到 96 孔培养板中,在 37°C、5% 二氧化碳(CO₂)条件下孵育 48 小时。移除细胞培养基,向每孔加入 50 微升(µL)裂解缓冲液,轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升纯样本转移至 384 孔小体积检测板,加入 4 微升总 SMAD4 HTRF 检测试剂,孵育过夜后记录信号。
该实验数据可为不同细胞系选择更适宜的细胞密度提供依据。结果显示,总 SMAD4 HTRF 检测可同时检测人源和鼠源 SMAD4 蛋白。
(图示标注:assay-validation-smad4-total,即 “总 SMAD4 细胞系兼容性验证”)
将野生型 HAPI 细胞(HAPI wt)以每孔 2.5 万个细胞的密度接种到 96 孔板中。
在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后,用 25 纳摩尔(nM)的 ON-TARGET 系列小干扰 RNA(siRNA,购自 Horizon Discovery)处理细胞,该 siRNA 可特异性靶向 SMAD2、SMAD3 和 SMAD4;同时设置非靶向 siRNA 处理组作为对照。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后,更换为完全培养基,继续在 37°C 条件下孵育 24 小时。
将 SMAD4 基因敲除 HAPI 细胞(HAPI SMAD4 KO,购自 Horizon Discovery)以每孔 2.5 万个细胞的密度接种,孵育 4 天。
孵育结束后,用 50 微升 4 号补充型裂解缓冲液(1 倍浓度)裂解细胞,取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板,加入 4 微升预混合的总 SMAD4 HTRF 检测抗体。在室温(RT)下孵育过夜后,记录 HTRF 信号。
结果显示:用 SMAD4 siRNA 处理的细胞,总 SMAD4 信号显著下调,与非靶向 siRNA 转染组相比,信号下降 50%;此外,在 SMAD4 基因敲除 HAPI 细胞的裂解液中未检测到信号。
另一方面,用 SMAD2 或 SMAD3 siRNA 处理的细胞,其信号未出现下降,这证明该试剂盒具有特异性。使用 HTRF 总 SMAD2 和总 SMAD3 检测试剂盒检测,确认 SMAD2 和 SMAD3 的表达已分别下调 60% 和 66%。
(图示标注:assay-validation-smad4-total-2、assay-validation-smad4-total-3、assay-validation-smad4-total-4,即 “总 SMAD4 检测特异性验证相关图示”)
将 HAPI 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养,在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养至 80% 汇合度。
用 3 毫升 4 号补充型裂解缓冲液(1 倍浓度)在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
用 4 号补充型裂解缓冲液(1 倍浓度)对细胞裂解液进行系列稀释,取 16 微升纯样本及各稀释度样本转移至 384 孔小体积微孔板,加入 4 微升总 SMAD4 HTRF 检测试剂,孵育过夜后记录信号。
取等量裂解液上样至凝胶,进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行对比。
结果显示,在该实验条件下,总 SMAD4 HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 16 倍。
(图示标注:assay-validation-smad4-total-5,即 “总 SMAD4 HTRF 检测与蛋白质印迹法对比结果”)
TGF-ß 信号传导由 I 型 TGF-ß 受体(TßRI)和 II 型 TGF-ß 受体(TßRII)复合物介导,该复合物通过磷酸化作用激活细胞内的 SMAD3 和 SMAD2。TGF-ß 配体与 TßRII 结合后,会诱导 TßRI 招募至配体 - 受体复合物中。TßRII 先发生自身磷酸化,随后磷酸化 TßRI。激活后的 TßRI 进而磷酸化 SMAD2 和 SMAD3,使其能够与苏氨酸 277(Threonine 277)位点磷酸化的 SMAD4 形成寡聚体。
该三聚体复合物随后转移至细胞核内,与共激活因子、共抑制因子共同作为转录因子,调控与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化,以及细胞外基质重塑、免疫 / 炎症反应相关的多种基因表达。抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制过程。
(图示标注:pathway-smad4-total,即 “TGF-ß 信号通路示意图”)
- 应用领域:细胞信号传导
- 自动化兼容性:是(Yes)
- 品牌:HTRF
- 检测方式:HTRF(均相时间分辨荧光)
- 裂解缓冲液兼容性:1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
- 分子修饰类型:总蛋白(Total)
- 产品类别:试剂盒
- 样本体积:16 微升(µL)
- 运输条件:干冰运输
- 靶点类别:磷酸化蛋白
- 靶点物种:人、小鼠
- 技术平台:TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)
- 治疗领域:心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化(NASH/Fibrosis)、肿瘤学与炎症
- 单位规格:10,000 个检测点