HTRF FGFR1 TOTAL KIT - 50K PTS

概述

Total-FGFR1细胞检测可监测总FGFR1，且能与磷酸化FGFR1试剂盒配合作为归一化检测。FGFR1的突变与多种癌症相关，包括肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌和卵巢癌等。工作原理

总FGFR1检测原理 HTRF总FGFR1检测可对细胞裂解物中FGFR1的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总FGFR1检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在FGFR1时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生FRET信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测形式下即可评估蛋白质的表达。 总FGFR1双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解物转移到384孔小体积检测板中，之后添加总FGFR1 HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总FGFR1单板检测方案 使用HTRF试剂检测总FGFR1可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 检测验证 多种人类癌细胞系中FGFR蛋白水平的评估 将不同的人类癌细胞系接种到T175培养瓶中的完全培养基中，在37°C、5% CO₂条件下培养。然后在室温下，用3mL补充的#4裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞30分钟。 对每种细胞系的25μg总蛋白和KG-1细胞系的15μg总蛋白进行总FGFR1、2、3和4蛋白水平分析。将16μL归一化的样品转移到384孔小体积白色微孔板中，并添加4μL HTRF总FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。结果显示四种不同的FGFR受体具有不同的表达模式。其中，FGFR1在DMS114肺癌细胞模型和KG-1骨髓性白血病模型中高表达；FGFR2在SNU-16和Kato-III胃癌模型中优先表达；FGFR3在KMS-11多发性骨髓瘤细胞系中表达；FGFR4在MDA-MD-453乳腺癌模型或HuH7肝癌细胞系中表达。此外，这些结果证明了HTRF总FGFR试剂盒的识别特异性。 使用磷酸化（Tyr653/654）和总FGFR1试剂盒测量抑制作用 将人类KG-1细胞（骨髓性白血病细胞）以200,000个细胞/孔的密度接种到半面积96孔培养处理板中，每孔加入25μL完全培养基。在37°C、5% CO₂条件下，用5μL不同浓度的FGFR抑制剂AZD4547处理细胞24小时。处理后，在室温下用10μL补充的#4裂解缓冲液（4X）在温和振荡下裂解细胞30分钟。 将人类DMS-114细胞（肺癌细胞）接种到96孔板中（100,000个细胞/孔）并孵育过夜。接着，在37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的AZD4547处理细胞24小时，然后用100ng/ml的FGF2刺激10分钟。处理后，在室温下用25μL补充的#4裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞30分钟。 细胞裂解后，将16μL裂解物转移到384孔白色小体积微孔板中，并添加4μL HTRF磷酸化FGFR1（Tyr653/654）或总FGFR1检测试剂。在室温下过夜孵育后记录HTRF信号。 正如预期的那样，结果显示用AZD4547处理后，FGFR1的Y653/654磷酸化水平呈剂量依赖性抑制，而FGFR1的表达水平保持不变。 HTRF总FGFR1检测与蛋白质印迹法的比较 将KG-1细胞在T175培养瓶中的完全培养基中培养，条件为37°C、5% CO₂。孵育72小时后，在室温下用3mL补充的#4裂解缓冲液（1X）在温和振荡下裂解细胞30分钟。 使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将16μL每种稀释液转移到白色小体积微孔板中，然后添加4μL HTRF总FGFR1检测试剂。使用等量的裂解物进行HTRF与蛋白质印迹法的平行比较。 蛋白质印迹法与HTRF的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF检测的灵敏度是蛋白质印迹法的4倍。

简化通路 FGFR信号传导的简化通路 FGFR是酪氨酸激酶受体，通过与FGF配体结合而被激活。这种结合会驱动受体同源二聚化，进而激活FGFR的酪氨酸激酶结构域和特定酪氨酸残基的磷酸化。被激活的受体成为多种蛋白质的停靠位点，这些蛋白质会诱导多个信号转导通路的下游激活，包括RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT通路。 FRS2α是与FGFRs持续结合的关键衔接蛋白。被激活的FGFR会磷酸化FRS2，从而招募GRB2和SOS来激活RAS以及下游的RAF和MAPK通路，特别是ERK1/2。GRB2还通过GAB1激活PI3K，然后PI3K会磷酸化AKT。独立于FRS2，PLCg与被激活的FGFRs的胞内部分结合，通过水解PIP2产生IP3和DAG。DAG激活PKC酶，这在一定程度上会增强MAPK通路的激活。根据细胞环境的不同，FGFRs还会激活其他通路，如STAT信号通路。 从FGFRs传递到细胞核的信号会调控多种生物学功能，如细胞增殖、分化、存活、黏附、迁移和血管生成。多种癌症中FGFRs的改变与FGFRs的过表达或过度活跃相关，这使得这些受体成为抗癌治疗的关键靶点。规格

其他规格 应用领域 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 分子修饰 总（蛋白） 产品类别 试剂盒 样品体积 16µL 运输条件 干冰运输 目标类别 磷酸化蛋白 目标物种 人类 技术 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域 肿瘤学与炎症 单位规格 50,000个检测点