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HTRF (H) FLT3 TOTAL KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述

HTRF 人 FLT3（Fms 样酪氨酸激酶 3，又称 FLK2）检测法可监测野生型 FLT3（FLT3 WT）和 / 或内部串联重复（ITD）FLT3 突变体，用于检测多种细胞中内源性或过表达的 FLT3。FLT3 是 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，进而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致免疫细胞无序增殖、未成熟化及致癌表型。FLT3 是急性髓系白血病（AML）中最常见的突变基因，其突变会导致受体激酶活性持续激活或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体在 AML 中的作用已得到明确，因此 FLT3 突变体成为制药行业的重要药物靶点，开发靶向 FLT3 降解的 PROTAC 化合物是治疗白血病（如 AML）的策略之一。

工作原理

HTRF 人总 FLT3 检测原理

HTRF 人总 FLT3 检测可对细胞裂解物中 FLT3 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人总 FLT3 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 FLT3 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的表达情况。

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人总 FLT3 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入人总 FLT3 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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人总 FLT3 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测人 FLT3 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

总 FLT3 检测的特异性

在 96 孔板中（100,000 个细胞 / 孔），用 100 µL 培养基培养 HEK293 细胞，分别转染 100 ng 人 FLT3 质粒、空质粒或不转染，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充裂解缓冲液 #4（1X）在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF（人）总 FLT3 检测抗体。室温孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

与转染空质粒的细胞相比，HTRF（人）总 FLT3 检测能有效检测转染人 FLT3 质粒的细胞中的 FLT3。

未转染细胞或转染空质粒的细胞均未产生信号，证明了该试剂盒的特异性。

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HTRF 人总 FLT3 试剂盒在内源性人白血病细胞系和瞬时过表达人 FLT3 的 HEK293 细胞中的验证

人白血病 THP-1 细胞、人白血病 MV4-11 细胞和转染人 FLT3 的 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用补充裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞，THP-1 和 MV4-11 细胞的最终密度为 25×10⁶个细胞 /mL，转染的 HEK293 细胞最终密度为 3×10⁶个细胞 /mL。

用 HTRF（人）总 FLT3 试剂盒评估 FLT3 蛋白的表达水平：将 16 µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂，室温孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

THP-1 细胞表达内源性野生型 FLT3（FLT3 WT），MV4-11 细胞表达内源性内部串联重复（ITD）FLT3 突变体，HEK293 细胞过表达 FLT3 WT。在所有测试的人细胞系中均检测到不同水平的 FLT3 蛋白。

对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度以确保检测在试剂盒的动态范围内。HTRF（人）总 FLT3 检测能有效检测多种人细胞模型中内源性和过表达的野生型 FLT3 或 ITD FLT3 突变体（无论其蛋白表达水平如何）。

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HTRF 人总 FLT3 检测与蛋白质印迹法的比较

转染人 FLT3 的 HEK293 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 3 mL 补充裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF（人）总 FLT3 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF（人）总 FLT3 检测时，每孔 200 个细胞即可检测到显著信号，而蛋白质印迹法需要 1,500 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，HTRF（人）总 FLT3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 7.5 倍。

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简化通路

FLT3 信号通路

FLT3 是 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体二聚化并激活多种通路，包括 PI3K 和 MAPK 通路，进而调控免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路失调可能导致细胞无序增殖、免疫细胞未成熟及致癌表型。FLT3 基因突变会导致受体激酶活性持续激活或破坏其自身抑制活性，其中 ITD FLT3 突变体无需 FLT3L 即可激活下游通路。FLT3 在白血病（尤其是急性髓系白血病，AML）的发生发展中具有重要作用。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64FLT3TPEG

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