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HTRF MKK4 P-S257 KIT - 500 PTS

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概述

这款基于细胞的 HTRF 检测可便捷、准确地定量 Ser257 位点磷酸化的 MKK4（丝裂原活化蛋白激酶激酶 4）。在细胞应激和促炎细胞因子的刺激下，TAK1、Tpl2 或 ASK1 等多种 MKK 激酶可诱导 MKK4 的 Ser257 位点发生磷酸化。MKK4 磷酸化后，会优先触发 JNK 的激活，而 JNK 可调控一系列与肿瘤发生、神经退行性疾病及纤维化相关的生物学过程。

工作原理

磷酸化 MKK4（Ser257）检测原理

磷酸化 MKK4（Ser257）检测用于测定 Ser257 位点磷酸化的 MKK4。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且可在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 MKK4（Ser257）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 MKK4（Ser257）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 MKK4（Ser257）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 MKK4（Ser257）可在单个用于培养、刺激和裂解的微孔板中进行，无需洗涤步骤。这种专为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

phospho-how-it-works-phospho-mkk4-s257-1-plate-assay-protocol

检测验证

茴香霉素对维甲酸（RA）分化的 SH-SHY5Y 细胞的剂量反应

将人 SH-SY5Y 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞置于含 10 µM 维甲酸（RA）的分化培养基中，在暗处培养 1 周。需注意，由于 RA 稳定性较差，含新鲜 RA 的细胞培养基需每日更换。细胞分化后，用不同浓度的茴香霉素刺激 45 分钟。随后移除培养基，加入 50 µL 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如其他研究所述，茴香霉素可诱导 MKK4 的 Ser257 位点发生剂量依赖性磷酸化，而在相同实验条件下总 MKK4 水平略有下降。

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H₂O₂对维甲酸（RA）分化的 SH-SHY5Y 细胞的刺激作用

将人 SH-SY5Y 细胞以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 6 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，将细胞置于含 10 µM 维甲酸（RA）的分化培养基中，在暗处培养 1 周。需注意，由于 RA 稳定性较差，含新鲜 RA 的细胞培养基需每日更换。细胞分化后，用 0.5 mM H₂O₂刺激 1 小时。随后移除培养基，加入 500 µL 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

H₂O₂可诱导 MKK4 的 Ser257 位点发生磷酸化，而在相同实验条件下 MKK4 的表达水平基本保持稳定。

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茴香霉素对 HepG2 细胞的剂量反应及与蛋白质印迹法的相关性

将人 HepG2 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用不同浓度的茴香霉素刺激 45 分钟。随后移除培养基，加入 50 µL 1X 补充裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）或总 MKK4 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。同时，取等量裂解物通过蛋白质印迹法进行平行实验分析。

结果如图表所示，HTRF 检测和蛋白质印迹法均显示 MKK4 磷酸化水平升高，同时 MKK4 表达水平下降。

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HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HepG2 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。随后用 1 M 山梨糖醇刺激细胞 30 分钟，然后进行裂解。

用补充裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）检测试剂。取等量裂解物通过 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行对比。

使用 HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）检测时，每孔仅需 310 个细胞即可检测到信号；而依赖化学发光信号的蛋白质印迹法则需要 5,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 磷酸化 MKK4（Ser257）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

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简化通路

MKK4 检测的简化通路
MKK4（丝裂原活化激酶激酶 4）是 MAP 激酶激酶家族的成员。在 GPCR 激活、生长因子、细胞应激或炎症细胞因子等刺激下，TAK1 或 ASK1 等不同的 MKKK 被激活，进而诱导 MKK4 的 Ser257 位点发生磷酸化，使 MKK4 激活。激活的 MKK4 反过来会磷酸化 JNK 或 p38，从而激活 c-jun、p53 或 ATF2，并通过调控基因转录诱导炎症、细胞存活 / 凋亡、增殖或分化过程。

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规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、神经科学、肿瘤与炎症
单位规格：500 次检测

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